Что такое ифа диагностика. Иммуноферментный анализ (ELISA)

Метод диагностики (ИФА) является информативным и не слишком затратным, поэтому многие лаборатории предлагают своим клиентам данный метод (иммуноферментного анализа крови). Исследование проводится натощак, кровь для анализа берут из локтевой вены пациента. Перед ИФА желательно не курить и не употреблять алкоголь.

Что такое анализ крови, проводимый методом ИФА

Среди методов анализа крови, позволяющих оценить способность организма противостоять инфекционным болезням и показывающих фазу болезни, важное место занимает иммуноферментный анализ (ИФА). Проведение этого исследования позволяет всесторонне оценить деятельность защитной функции крови и выявить состояние иммунодефицита при инфекционных патологиях, также заболеваниях крови, аутоиммунных процессах, гормональных проблемах.

Это лабораторное исследование, которое позволяет определять наличие специфических антител (защитных факторов крови белковой природы) к определенным антигенам (болезнетворным агентам). Среди антител первостепенное значение имеют иммуноглобулины, которые могут существовать в виде иммунокомплексов.

Иммуноглобулины вырабатываются вследствие сложных нейрогуморальных реакций иммунитета человека, возникающих как ответная реакция на внедрение чужеродных антигенов. На каждый вид болезнетворного агента вырабатываются свои специфические антитела. Действуют они путем «связывания» антигена или патологического микроорганизма, образую комплексное соединение «антиген-антитело» с последующей нейтрализацией, ферментативным лизисом, реакциями фагоцитоза и выводом из организма.Именно по наличию определенных комплексов методом ИФА определяется вид возбудителя или имеющегося у больного вредного вещества.

Стоит помнить, что после пройденного курса лечения антитела могут оставаться в нашем организме очень долго, даже после того, как инфекция покинула наше тело, т.е. остается, так называемый, «серологический шрам». Приведем пример: в ночном небе тысячи звезд. Многие из этих звезд уже давно погибли, но до нас до сих пор, веками, идет их свет. По сути, мы видим только след звезды. Свет есть, а звезды уже давно нет.

Но если света нет, это не говорит о том, что звезды там не было. То же самое и с антителами. Их наличие не гарантирует присутствия в организме искомого инфекционного агента. Отсутствие антител не говорит о том, что инфекции нет. Если результат анализа методом ИФА положительный, то это значит, что нужно искать инфекцию более специфическими и дорогостоящими методами - ПЦР, бактериологические посевы. Возможен ложноположительный результат в случае, если несколько микробов обладают схожей антигенной структурой, тогда к разным микробам будут вырабатываться «похожие» антитела.

Какие бывают иммуноглобулины

Открыто и изучено 5 основных классов иммуноглобулинов – IgА, IgM, IgG, IgD, IgE. роль остальных еще до конца не выяснена и она находятся в стадии научного исследования.

Основная задача иммуноглобулина А (IgA) заключается в защитных функциях слизистых оболочек дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта и мочевыделительной системы. При остром начале заболевания выявить их невозможно. Появляются эти защитные комплексы лишь со 2 недели начала заболевания, иногда позже. Основная масса иммуноглобулина А сосредоточена в слизистых тканях. Ориентировочно около 80%. Остальные антитела циркулируют в крови.

Основная функция – обезвреживание и уничтожение микроорганизмов. После стихания острых проявлений заболевания количество этих иммуноглобулинов начинает уменьшаться и полностью уходит на сроке до 8 недель после начала болезни. Если IgA обнаруживаются в более поздние сроки, то это свидетельствует о хронизации процесса.

Главными и первыми маркерами острой фазы развивающейся патологии являются иммуноглобулины класса М (IgM). Обнаруживаются они к 5 суткам начала недомогания. Определить их наличие в крови можно около 6 недель. Затем они начинают быстро исчезать.

Остаточный иммунный ответ характеризует наличие в крови иммуноглобулинов класса G (IgG). Появление этих факторов в крови обнаруживается примерно через месяц после начала болезни. В дальнейшем они могут определяться в течение многих месяцев, лет и даже всю жизнь, выполняя защитную функцию от возврата (рецидива) болезни, а в некоторых случаях делая невозможным вторичное развитие патологии.

Если же количество иммуноглобулина G начало вновь расти, то можно подозревать повторное заражение. Подобный вывод можно сделать путем проведения двух-трех проб, сделанных с промежутком в 2 недели.

Как проводится ИФА крови

Для иммуноферментного анализа в большинстве случаев используется кровь пациентов, иногда производят забор ткани стекловидного тела, жидкости спинномозгового канала, околоплодных вод.

Кровь набирают через инъекционную иглу в шприц из локтевой вены. Исследование проводят натощак. Следует помнить, что прием некоторых медицинских препаратов может влиять на результат анализа. Перед сдачей крови необходимо воздержаться от курения, приема алкоголя. Исказить результаты может прием наркотических веществ.

В случае отрицательных значений иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA можно говорить об отсутствии заболевания или его начальной фазе, также результат с минусами возможен при полном выздоровлении по прошествии значительного количества времени.

Если IgA и IgM не обнаружены, а IgG проявляется положительно, то по всей вероятности речь идет о сформированном иммунитете после инфекционного заболевания, или после прививки.

В случае высокого титра IgM при отрицательных значениях IgG, IgA можно делать вывод о наличии остро протекающего инфекционного заболевания.

Одновременные положительные значения результатов иммуноглобулинов – IgA, IgM, IgG характерны для острой фазы рецидива имеющегося хронического заболевания.

Что дает представленная технология: определение наличия гельминтов в крови; поиск других болезнетворных микроорганизмов в теле; можно узнать причины ухудшения вашего здоровья; лечение строится также на анализах, полученных таким способом; вы можете следить за состоянием своей иммунной системы.

Еще одна хорошая черта – возможность отслеживать онкологические маркеры вне зависимости от их происхождения, но при условии их присутствия в организме, разумеется. Данный тест пригоден и для описания состояния репродуктивной системы человека. Наличие определенных белков, гормонов и пептидов, позволяют судить о потенциале партнера в плане зачатия ребенка, а также предположительном качестве будущего плода.

Анализ крови на лямблии – довольно популярная практика у современных медиков. К тому же, данный метод исследования является прекрасным инструментом для биомедицинской аналитики и количественной статистики в плане специфичных антигенов.

Каким образом используется иммуноферментный анализ методом ИФА

Правда, это более сложные случаи, поэтому качество подобного анализа будет сильно зависеть от работников лаборатории, выполняющей тестирование. Особенности технологии и отличие ее от старых лабораторных исследований:

теперь вместо пробы кала используется кровь, для определения наличия гельминтов;
изучение пробы проводится в лаборатории очень быстро, уже на следующий день можно получить полную информацию;
стоимость лабораторного исследования недорогое, так как теология очень проста;
анализ крови на гельминтов дает высокие показатели точности.

Анализы при иммунологическом анализе крови методом ИФА

О том, какие бывают анализы крови с точки зрения иммунологической системы человека, мало кто знает, так эти анализы не так распространены. Как правило, такое исследование крови дает информацию о вирусе иммунодефицита в организме человека и является анонимной, так как проводится по желанию пациента.

Для забора используют взятую натощак из вены кровь, из которой для исследования методом центрифугирования получают сыворотку. Кроме этого, изучение сыворотки крови способно выявить ряд венерических заболеваний (сифилис, герпес, хламидиоз), а также все виды гепатита, корь, краснуху, паротит и токсоплазмоз.

В основном, для проведения ИФА анализа, исследуемым биологическим материалом является кровь, однако, исследованию может подвергаться спинномозговая жидкость, содержимое стекловидного тела, околоплодные воды и др.

Иммуноглобулины - это иммунные молекулы, способные связываться и нейтрализовать большинство инфекционных возбудителей и токсинов в организме. При этом важнейшей характеристикой иммуноглобулинов является их специфичность, то есть способность связываться с определенным антигеном. Именно это свойство используется для проведения анализа крови на иммуноглобулин.

Существует пять типов иммуноглобулинов, однако наиболее изученными являются иммуноглобулины А, М, и G. Иммуноглобулины М и G проявляют свою активность в крови. Иммуноглобулины А являются, своего рода, барьером на поверхности слизистых оболочек, так как присутствуют там в большом количестве.

Иммунологический анализ крови позволяет определять тип иммуноглобулинов, благодаря этому ИФА позволяет не только диагностировать заболевание, но и определить стадию данного и отслеживать динамику заболевания:

в первые 2 недели заболевания обнаруживаются только иммуноглобулины А;
со 2-й по 3-ю неделю заболевания в крови обнаруживаются иммуноглобулины А и М.;
Сс3 по 4 неделю анализ крови на иммуноглобулин определяются все три типа;
при выздоровлении в крови пропадают иммуноглобулины М, а количество А и G снижается в 2 – 4 раза;
при наличии хронического процесса в крови обязательно присутствуют иммуноглобулины G, иммуноглобулины М отсутствуют, иммуноглобулины А могут как присутствовать, так и отсутствовать.

Область применения иммунологического анализа крови методом ИФА

Диагностика вирусных заболеваний: гепатиты, герпес, Эпштейн-Барр вирус, цитомегаловирус и др;
инфекции передающиеся половым путем: хламидиоз, гонорея, трихомонада, микоплазма, уреаплазма;
сифилис; эндокринология (определение уровня гормонов);
онкомаркеры (диагностика онкологических заболеваний); иммунология (диагностика иммунодефицита);
аллергология (диагностика и лечение аллергий).

Серологический анализ крови - лабораторный метод исследования крови, который применяется с целью диагностики инфекционных заболеваний и определения стадии инфекционного процесса. Серологическая реакция основана на взаимодействии антител и антигенов.

Определение антигенов используют для определения родовой и видовой принадлежности микроорганизмов. Данный метод исследования применяется в урологии и венерологии. Кровь для серологического анализа крови берется утром натощак из вены.

Показания к назначению и выявляемые заболевания методом ИФА

Основной биоматериал для проведения ИФА - это сыворотка крови: в лаборатории у пациента берут образец крови из вены, из которого в дальнейшем удаляют форменные элементы, затрудняющие проведение анализа. В некоторых других случаях для анализа используется спинномозговая жидкость, околоплодные воды, мазки слизистых оболочек и т.д.

Для того чтобы избежать искажений в результатах, рекомендуется сдавать кровь натощак, а за две недели до исследования (если целью является диагностика хронических, скрыто протекающих инфекционных заболеваний) необходимо отказаться от приема антибиотиков и противовирусных препаратов.Невозможно охватить полный список показаний к проведению ИФА.

Бесспорные преимущества ИФА - высокая чувствительность и специфичность метода. Чувствительность - это возможность распознать искомое вещество, даже если его концентрация в образце невысока. Специфичность же подразумевает безошибочность диагностики: если результат положительный, значит, найдены именно те антитело или антиген, которые предполагались, а не какие-то другие.

ИФА во многом заменил «золотой стандарт» микробиологии - бактериологический метод диагностики, в ходе которого для идентификации возбудителя требовалось выделить его из организма, а затем в течение нескольких дней выращивать культуру на питательной среде в пробирке.

Все то время, пока производился анализ, врачи были вынуждены лечить пациента «вслепую», догадываясь о происхождении микроорганизма по симптомам болезни. Определение IgM с помощью ИФА позволяет поставить точный диагноз уже в первые дни болезни.

Высокая степень технологичности проведения иммуноферментного анализа минимизирует влияние человеческого фактора, что снижает вероятность ошибки. Большинство используемых в современных лабораториях тест-систем и реактивов для ИФА выпускаются в промышленных условиях, что гарантирует точный результат.

Недостатки метода ИФА

К сожалению, для проведения ИФА нужно знать, что именно искать: методика анализа подразумевает, что врач заранее имеет предположение о природе заболевания. Поэтому нет смысла назначать такой тест в надежде случайно «угадать» диагноз.

В случае диагностики инфекционных заболеваний иммуноферментный анализ не может найти возбудителя и определить его специфичные свойства: он лишь указывает на наличие антител в крови у больного, косвенно свидетельствующих о присутствии чужеродного микроорганизма в теле человека. ИФА - крайне точный, но не дешевый метод, поэтому обращаться к нему нужно с умом, а интерпретацией результатов должен заниматься квалифицированный врач.

Возможные результаты ИФА

В зависимости от содержания анализа в бланке могут быть представлены данные в виде таблицы с перечислением всех антител или антигенов с пометками об отрицательной или положительной реакции, либо будет указано количественное значение результата (отрицательный, слабоположительный, положительный или резко положительный).

Последний вариант определяет, сколько антител содержится в анализируемом образце. Еще один количественный показатель - индекс авидности антител, выраженный в процентах. Он указывает, сколько времени прошло от начала инфекционного процесса (чем выше индекс - тем больше).

Сегодня выпускаются тысячи видов тест-систем ИФА, позволяющих обнаруживать специфические антитела и антигены при самых разных патологиях. Поэтому этот анализ используется практически во всех медицинских отраслях. Диагноз, поставленный с помощью ИФА, - это гарантия назначения адекватной терапии и эффективного лечения заболевания.

При наличии необходимых реактивов и хорошей организации работы лаборатории результат анализа вы получите в течение 1–2 суток после забора крови. В некоторых случаях, при необходимости получения экстренного ответа, этот срок может быть сокращен до 2–3 часов.

ИФА (иммуноферментный анализ, ELISA – англ.) вошел в жизнь практической медицины еще где-то в 60-х прошлого столетия. Первоначальной его задачей были гистологические исследования в научных целях, которые сводились к поиску и идентификации антигенной структуры клеток живого организма.

В основе метода ИФА лежит взаимодействие специфических (АТ) и родственных антигенов (АГ) с образованием комплекса «антиген – антитело» , который выявляют при помощи фермента. Этот факт натолкнул ученых на мысль, что метод может быть использован в диагностических целях для выявления специфических иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе на ту или иную инфекцию. И это был прорыв в клинической лабораторной диагностике!

Активно использоваться метод начал только в начале 80-х и то, в основном, в специализированных учреждениях. Первыми иммуноферментными анализаторами были снабжены центры и станции переливания крови, инфекционные и венерологические стационары, поскольку рожденный на африканском континенте, появившийся на горизонте у нас и тут же примкнувший к «старым» инфекциям грозный СПИД, требовал незамедлительных мер диагностики и поиска лечебных препаратов, воздействующих на него.

Область применения метода ИФА

Возможности иммуноферментного анализа поистине обширны. Теперь и представить себе трудно, как можно обойтись без подобных исследований, применяемых буквально во всех отраслях медицины. Кажется, что может сделать ИФА в онкологии? Оказывается, может. И многое. Способность анализа находить маркеры, свойственные некоторым видам злокачественных новообразований, лежит в основе раннего выявления опухоли, когда другим способом она еще не определяется из-за своих небольших размеров.

Современная клиническая лабораторная диагностика (КДЛ), кроме онкомаркеров, располагает значительным арсеналом панелей для ИФА и использует их для диагностики различных патологических состояний (инфекционных процессов, гормональных нарушений) и мониторинга фармацевтических лечебных препаратов с целью выявления их влияния на организм больного и, кстати, не только человека. В настоящее время иммуноферментный анализ широко используется и в ветеринарной службе, ведь «братья наши меньшие» тоже подвержены многим заболеваниям, от которых, порой, очень сильно страдают.

Таким образом, ИФА, благодаря своей чувствительности и специфичности, по образцу крови, взятому из вены, может определить:

Гормональный статус (гормоны щитовидной железы и надпочечников, половые гормоны);
Присутствие вирусной и бактериальной инфекции (ВИЧ, В и С, хламидиоз, сифилис, и , и , а также многие другие болезни, вызванные патогенными микроорганизмами);
Следы жизнедеятельности микроорганизмов, возбудивших инфекционный процесс, который благополучно закончился и перешел в стадию формирования иммунного ответа на этот возбудитель. Такие следы, то есть, антитела, во многих случаях остаются циркулировать в крови пожизненно, чем защищают человека от повторного заражения.

В чем суть ИФА?

Иммуноферментный метод, позволяет определить не только присутствие самого возбудителя (качественный анализ), но и его количественное содержание в сыворотке крови больного.

Вирусовая или бактериальная доза существенно влияет на течение инфекционного процесса и его исход, поэтому количественному анализу отведена не последняя роль в диагностике и лечении заболеваний в различных формах и стадиях.

Однако зная иммуноферментные исследования, как метод ИФА, мы даже не задумываемся, как же ему удается охватить такой широкий круг микроорганизмов, населяющих нашу планету, многие из которых несут прямую угрозу здоровью и жизни человека и животных. А дело в том, что ИФА имеет много вариантов (неконкурентный и конкурентный – прямой и непрямой), каждый из которых решает свою задачу и, таким образом, позволяет проводить целенаправленный поиск.

Для выявления иммуноглобулинов того или иного класса используется традиционная 96-луночная полистироловая панель (планшет), в лунках которой в твердой фазе сосредоточены сорбированные рекомбинантные белки. Попавшие в лунку с сывороткой крови антитела или антигены, находят «знакомый» объект и образуют с ним комплекс (АГ – АТ), который, закрепившись ферментным конъюгатом, при считывании результатов проявится изменением окраски лунки.

Иммуноферментный анализ проводится на тест-системах определенной специфичности, изготовленных в специальных лабораториях и укомплектованными всеми необходимыми реагирующими компонентами. Исследования можно проводить с помощью промывных аппаратов («вошеров») и считывающих спектрофотометров, где большей частью задействован ручной труд. На полных автоматах, освобождающих лаборанта от монотонного закапывания, промывания и прочих рутинных дел, конечно, работать быстрее и удобнее, но не все лаборатории могут позволить себе такую роскошь и продолжают работать по старинке – на полуавтоматах.

Интерпретация результатов ИФА находится в компетенции врача лабораторной диагностики, при этом обязательно берется в расчет и присущее практически всем иммунохимическим реакциям свойство давать ложноположительные или ложноотрицательные ответы.

Видео: современное проведение иммуноферментного анализа

Результаты ИФА на примере сифилиса

Иммуноферментный анализ подходит для выявления всех форм , а, кроме этого, применяется в проведении скрининговых исследований. Для проведения анализа используют венозную кровь пациента, взятую натощак. В работе используются планшеты с определенной специфичностью (АТ классов А, М, G) или суммарные антитела.

Учитывая то, что АТ при сифилисе продуцируются в конкретной последовательности, ИФА может легко ответить на вопрос, когда произошло заражение и в какой стадии находится процесс, а расшифровка полученных результатов может быть представлена в следующем виде:

IgM указывают на продолжительность инфекционного процесса (могут появляться при обострении хронических воспалительных заболеваний);
IgA констатируют, что заражение случилось более месяца назад;
IgG свидетельствуют о том, что инфекция находится в самом разгаре или о проведенном недавно лечении, что легко выясняется при сборе анамнеза.

При проведении анализа на сифилис, лунки с отрицательным ответом (и отрицательный контроль) останутся бесцветными, в то время как положительный результат (как и положительный контроль) даст ярко-желтое окрашивание за счет изменения цвета хромогена, добавленного в ходе исследования. Однако интенсивность окраски не всегда совпадает с контролем, то есть, она может быть немного бледнее или слегка желтоватой. Это сомнительные результаты, которые, как правило, подлежат повторному исследованию с обязательным учетом количественных показателей, полученных на спектрофотометре, но в целом, окраска находится в прямо пропорциональной зависимости от количества иммунных комплексов (связанные между собой АГ и АТ).

Самый волнительный из иммуноферментных анализов – ИФА на ВИЧ

Анализ на , пожалуй, больше других интересен широкому кругу населения, ведь пока нельзя с уверенностью утверждать, что исчезли многие социальные проблемы (проституция, наркомания и др.). К сожалению, ВИЧ затрагивает не только эти слои человеческого общества, заразиться можно при различных обстоятельствах, не связанных с половой распущенностью или приемом наркотиков. Но коль возникла необходимость обследования на ВИЧ, то бояться не следует, что все вокруг узнают о посещении такой лаборатории. Сейчас ВИЧ-инфицированные люди защищены законом, а сомневающиеся могут обратиться в анонимные кабинеты, где можно решить проблему, не боясь огласки и осуждения.

Иммуноферментный метод, применяемый для диагностики ВИЧ инфекции, относится к первостепенным стандартным исследованиям, которые, однако, требуют особых условий, поскольку тема очень деликатная.

ИФА на ВИЧ имеет смысл проводить после полового контакта, переливания крови, других медицинских манипуляций , предполагающих заражение, и по окончании инкубационного периода («серонегативное окно»), но следует учитывать, что этот промежуток времени не является постоянным. Он может закончиться через 14-30 дней, а может продолжаться до полугода, поэтому средним значением принято считать интервал от 45 до 90 дней. На ВИЧ кровь сдают так же, как и на другие инфекции – из вены на голодный желудок. Результаты будут готовы в зависимости от накопления материала в лаборатории и ее загруженности (от 2 до 10 дней), хотя чаще всего лаборатории обеспечивают получение ответа в тот же день или на следующий.

Что можно ожидать от результатов на ВИЧ?

ИФА на ВИЧ-инфекцию определяет антитела к двум разновидностям вируса: ВИЧ-1 (более распространенный в России и других странах Европы и Азии) и ВИЧ-2 (встречающийся чаще на территории Западной Африки).

Задачей ИФА ВИЧ является поиск АТ класса G, которые выявляются на всех тест-системах, но в более позднем периоде, и АТ классов А и М, выявляемых на рекомбинантных тест-наборах нового поколения, позволяющих найти антитела на самых ранних стадиях (инкубационный период – «серонегативное окно»). От ИФА можно ожидать следующие варианты ответов:

Первичный положительный результат: кровь подлежит перепроверке на тест-системе такого же типа, но по возможности другой серии и другим человеком (лаборантом);
Повторный (+) предполагает новый забор крови у пациента с исследованием ее подобно первичному анализу;
Очередной положительный результат подлежит референтному анализу, при котором используются высокоспецифичные тест-наборы (2-3 шт.);
Положительный результат в обеих (или в трех) системах направляется на иммуноблотинг (тот же ИФА, но выполненный в индивидуальном порядке на тест наборах особо высокой специфичности).

Заключение о ВИЧ инфицировании выносится только на основании иммуноблотинга. Проводится беседа с инфицированным в условиях полной конфиденциальности. Разглашение медицинской тайны в России, как, впрочем, и в других странах, подлежит уголовному наказанию.

Анализы на хламидии и цитомегаловирус иммуноферментным методом также обрели особую популярность, ввиду того, что позволяют определить время заражения, стадию заболевания и эффективность лечебных мероприятий.

При внедрении тоже можно наблюдать появление антител различных классов в разных фазах патологического состояния, вызванного инфекционным агентом:

IgM могут обнаружиться уже дней через семь после заражения;
IgA говорят о том, что инфекция в организме живет уже более месяца;
IgG подтверждают диагноз хламидиоза, помогает следить за лечением и определить его действенность. Следует заметить, что антитела класса G остаются и циркулируют в организме независимо от давности болезни, поэтому для правильной расшифровки анализа нужно принимать во внимание референтные значения (нормы), которые, кстати, для каждой КДЛ свои: с учетом марки тест-системы и специфичности реагентов, входящих в набор. Значения нормы вписываются в бланк рядом с результатом ИФА.

Что касается , то здесь несколько иначе: антитела класса М появляются приблизительно через месяц-полтора, то есть, положительным результат (IgM+) становится в фазе первичного инфицирования или при реактивации скрытой инфекции и остается таковым от 4 месяцев до полугода.

Наличие АТ класса G характерно для начала первичной острой инфекции или реинфекции. Анализ констатирует, что вирус имеет место, однако информации, в какой стадии находится инфекционный процесс – не дает. Между тем, определение нормы титра IgG тоже вызывает затруднения, так как она целиком зависит от иммунного статуса конкретного человека, который, впрочем, устанавливается выявлением иммуноглобулинов класса G. Учитывая такое поведение антител, при диагностике ЦМВИ возникает необходимость в оценке способностей антител класса G взаимодействовать с ЦМВ, чтобы потом «обезвредить» его (авидность АТ). На начальном этапе болезни IgG очень плохо связываются с антигенами вируса (низкая авидность) и лишь потом начинают проявлять активность, стало быть, можно говорить о повышении авидности антител.

О достоинствах иммуноферментного анализа можно говорить долго и много, ведь этот метод сумел решить многие диагностические задачи, используя лишь венозную кровь. Не нужно долгих ожиданий, волнений и проблем с забором материала для исследования. К тому же тест-системы для ИФА продолжают совершенствоваться и не за горами тот день, когда тест выдаст 100% достоверность результата.

Видео: учебный фильм МГМУ им. Сеченова об основах ИФА

ИФА или иммуноферментный анализ относится к серологическим исследованиям и предназначен для обнаружения и диагностики патологических микроорганизмов в сыворотке крови.

Посредством анализа определяют различные классы иммуноглобулинов к бактериям: IgM — при остром патологическом процессе, а IgG на стадии выздоровления, которые в отдельных случаях сохраняются на протяжении всей жизни.

Посредством иммуноферментной диагностики выявляют заболевания различной этиологии:

Также ИФА показан для диагностирования сифилиса при подтверждении положительных результатов методом РВ, и позволяет отслеживать эффективность лечения при патологическом процессе.

Иммуноферментный анализ назначается по показаниям (при подозрении на заражение микроорганизмами), является обязательным при беременности и перед хирургическими операциями для выявления носительства различных бактерий.

Процедура анализа производится утром натощак, материал (кровь) забирается из вены. Результаты диагностического исследования готовятся до 10 дней.

Положительный ИФА

Положительный результат ИФА подтверждается наличием иммуноглобулинов класса IgG и IgM. Выявленные титры в крови IgM всегда указывают на болезнь в прогрессирующей стадии, у здорового человека данные антитела отсутствуют.

А IgG свидетельствует о перенесенной ранее инфекции, либо о носительстве патогенных микроорганизмов, некоторые из которых в незначительном количестве расцениваются в пределах нормы. К примеру, бактерии стрептококков и стафилококков присутствуют в каждом человеческом организме.

Сифилис

Антитела IgM при сифилисе обнаруживаются со 2 недели после заражения и указывают на наличие первичного, вторичного или врожденного эпизода, при лечении они исчезают приблизительно через полгода, при отсутствии терапии — через 18 месяцев. Если одновременно выявляются оба вида иммуноглобулинов – подтверждается сифилис в острой фазе. У переболевших людей антитела IgG к сифилису остаются в сыворотке пожизненно.

Вирусные гепатиты

IgM к вирусному гепатиту часто выявляются еще в инкубационном периоде заболевания, до появления первых проявлений и сохраняются во время течения болезни, после излечения – не определяются. Исключение составляет вирусный гепатит С, при котором IgM обнаруживаются как на его активной, так и скрытой или хронической стадии

Антитела IgG на гепатит А могут присутствовать даже у здоровых людей, что обусловлено перенесенной инфекцией или снижением иммунитета, а наличие IgG к гепатитам В, С и D у здоровых людей не наблюдается.

ЦМВИ

ЦМВИ распространена практически повсеместно и не представляет угрозы здоровью населения. Однако несет смертельную опасность для новорожденного и плода при внутриутробном инфицировании.

Выявление антител IgM к цитомегаловирусу указывает на первичное инфицирование или активацию латентной фазы. Титры IgG сохраняются у переболевших людей на протяжении 10 лет.

Герпес

Антитела к вирусу герпеса у здоровых людей в норме отсутствуют. Содержание IgM указывает на острую фазу заболевания, IgG – на скрытую (в данном случае человек является носителем инфекции). При содержании IgG к герпесу следует знать, что вирус в любое время способен активизироваться из латентной стадии в прогрессирующую.

Ветряная оспа

При ветряной оспе и в течение 2 лет после излечения в крови сохраняются иммуноглобулины класса IgM. В норме у здоровых людей антитела к ветряной оспе не выявляются.

Болезни, вызываемые стафилококками и стрептококками

У всех людей присутствуют иммуноглобулины к стафилококкам и стрептококкам. Поэтому диагностировать патологический процесс, вызванный данными группами бактерий можно посредством проведения двукратного иммуноферментного метода. Если отмечается нарастание титров при повторном ИФА (через неделю после первого), то анализ считается подтвержденным.

Хламидиоз

О положительном результате на хламидии свидетельствует выявление IgM титрами 1:8 и выше, и класса IgG – 1:64 и выше, которые повышаются во время течения болезни и достигают высоких значений. К примеру, у детей с хламидийной пневмонией, титры повышаются до 1:2000 – 1:4000. Наличие IgM свидетельствует об активности хламидий, через некоторое время после инфицирования в крови выявляются глобулины IgG.

Об отрицательном иммуноферментном анализе свидетельствует отсутствие антител IgM . Определяющиеся IgG не во всех случаях расценивают как подтверждение диагностического исследования, часто они сохраняются на протяжении нескольких лет после перенесенной инфекции, иногда пожизненно.

После сифилиса, инфекционного мононуклеоза иммуноглобулины IgG сохраняются на протяжении всей жизни и определяются в сыворотке крови. На протяжении 10 лет остаются микроорганизмы ЦМВИ, кори, краснухи, токсоплазмоза.

Титры к амебиазу сохраняются от нескольких месяцев до нескольких лет. Антитела к бактериям стафилококка и стрептококка определяются абсолютно у всех людей в небольшом количестве.

В вышеперечисленных случаях выявление иммуноглобулинов IgG после перенесенных заболеваний позволяет расценивать результаты ИФА, как отрицательные.

Норма при беременности

В первом триместре беременности каждая женщина проходит полное обследование организма, которое включает в себя иммуноферментный анализ.

Обязательными являются исследования на токсоплазмоз, ЦМВИ, хламидии, герпес 2 типа (генитальный), краснуху, уреаплазму и микоплазму, так как эти заболевания несут серьезную угрозу для развития плода. Они способны проникать в организм ребенка, минуя плацентарный барьер.

А особую опасность представляют на протяжении первого триместра беременности и практически всегда ведут к внутриутробной гибели плода и самопроизвольному выкидышу .

Проблема вышеперечисленных болезней в том, что они часто протекают в бессимптомной стадии, без видимых клинических проявлений, и выявить их возможно только посредством иммуноферментной диагностики.

О хороших результатах анализа можно говорить, если микроорганизмы в сыворотке не выявляются. Определяющиеся IgG свидетельствуют о носительстве вирусов и требуют постоянного наблюдения за женщиной для оказания своевременной терапии при внезапном обострении. Положительный IgM сигнализирует о прогрессирующем патологическом процессе, и требует незамедлительного устранения возбудителя.

Выявление титров IgG на краснуху указывает на перенесенное ранее заболевание и является нормой при беременности. IgG к ЦМВИ также не несут особой угрозы для плода, однако, не исключается возможность обострения (частота проявления, примерно 1-2%).

Особую угрозу представляет собой наличие IgG к вирусу герпеса 2 типа или генитальному (ВПГ2), так как риск обострения значительно повышается во время родов. В гестационном периоде частота проявления острой фазы случается в 0,9% случаях. Поражение плода вирусом герпеса при прохождении половых путей происходит в 40% случаях и приводит к летальному исходу в 50%.

При перенесенном токсоплазмозе IgM могут сохраняться до 2 лет после лечения. Риск заражения плода в этом случае составляет 17% в первом триместре и увеличивается до 60% к третьему, так как основной путь инфицирования – трансплацентарный. Выявленные IgG к токсоплазмозу многие специалисты склонны оценивать, как отрицательный результат, который практически не представляет угрозы для течения беременности.

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА является высокочувствительным и высокоспецифичным иммунодиагностическим методом, с помощью которого проводят качественное и количественное определение различных веществ, обладающих свойствами антигена, гаптена (неполноценного антигена) или антитела. Метод ИФА широко используется для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний человека и животных и может также применяться для подтверждения качества иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП).

Принцип метода заключается в реакции специфического взаимодействия антигена с антителом с образованием иммунного комплекса и последующей детекции полученного комплекса с помощью спектрофотометрии, хемилюминесценции и других адекватных методик. Детекция может быть как прямой (когда исследуемое вещество само обладает ферментативной активностью, либо оно помечено ферментной меткой), так и косвенной или непрямой (когда исследуемое вещество, связавшееся с иммобилизованными на твердой фазе антителами, инкубируется с антителами, меченными ферментом). Качественный анализ позволяет получить информацию о содержании антигена или антитела в исследуемом материале по принципу «есть/»нет». При проведении количественного анализа определяют концентрацию антигена или антитела в исследуемом материале с использованием калибровочного графика.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Метод ИФА включает 3 основных этапа: 1) образование иммунного комплекса «антиген (исследуемое вещество) – специфическое к нему антитело» или наоборот; 2) формирование связи конъюгата с образовавшимся на предыдущем этапе иммунным комплексом или со свободными местами связывания (детерминантами); 3) преобразование субстрата под действием ферментной метки в регистрируемый сигнал в результате биохимической реакции.

Все методики выполнения иммуноферментного анализа классифицируются как гомогенные или гетерогенные.

Методики, в которых все 3 стадии ИФА проходят в растворе, и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, относятся к группе гомогенных методов ИФА. В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит процесс ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. В результате реакции антиген–антитело активность фермента восстанавливается. При образовании иммунного комплекса антиген–антитело, содержащего ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95 % по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена происходит связывание все больше антител, и сохраняется все больше свободных конъюгатов «антиген–фермент», способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Гомогенный метод ИФА проводится очень быстро. На анализ одного определения требуется 1 мин. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методов характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя и обязательна стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно-гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов – происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

Метод гетерогенного ИФА состоит из 3 основных этапов:

иммобилизация антигена или антитела на твердой фазе, полученный комплекс называется иммуносорбентом;
удаление несвязавшегося реагента и блокирование сайтов связывания на твердой подложке с помощью блокирующих белков, таких, например, как альбумин, казеин; инкубация анализируемого препарата с иммуносорбентом для того, чтобы произошло их связывание;

3) детекция благодаря ферментативной активности самого исследуемого вещества или благодаря связанной с анализируемым препаратом ферментативной метке (прямой вариант). В некоторых случаях производится дополнительная инкубация комплекса «иммуносорбент–исследуемое вещество» с вторичными антителами, конъюгированными с ферментативной меткой (непрямой вариант).

Количественное определение исследуемого вещества осуществляется путем добавления подходящего для используемого детектора субстрата и сравнения сигнала исследуемого вещества со стандартным образцом.

Метод гетерогенного ИФА подразделяют на неконкурентный ИФА и конкурентный ИФА. Схемы анализа могут быть модифицированы в процессе разработки лекарственного препарата в соответствии с необходимыми требованиями. Изменения должны быть указаны в фармакопейной статье или нормативной документации. Выбор способа постановки ИФА зависит от природы исследуемого вещества и его количества, так как разные виды ИФА обладают различной чувствительностью. Для оценки качества веществ, содержащих антитела, возможно использование специфичных антиидиотипических антител.

Неконкуретный метод ИФА

Неконкурентный метод ИФА подразделяется на несколько видов по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный (непрямой) конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген или антитело).

Прямой вариант ИФА

Может выполняться 2 способами. В первом случае исследуемое вещество (антиген) непосредственно иммобилизовано на твердой фазе; тогда связавшееся с антигеном меченое антитело является детектором. При выполнении теста иным способом используют иммобилизованные на твердой фазе антитела. В этом случае детектором является исследуемое вещество, меченное ферментом.

Косвенный (непрямой) вариант ИФА

При выполнении непрямого варианта ИФА антиген иммобилизован на твердой фазе. После блокировки к антигену прибавляют раствор специфических к нему антител. После инкубации образовавшийся комплекс антиген–антитело отмывают от несвязавшихся антител и добавляют меченный ферментом анти-иммуноглобулин (анти-Ig), выступающий в роли детектора. Анти-Ig детекторы коммерчески доступны для конкретных классов и подклассов Ig, что делает этот формат анализа удобным для изотипирования антител. Кроме того, использование меченого анти-Ig усиливает сигнал по сравнению с прямым методом иммуноферментного анализа, тем самым увеличивая чувствительность анализа.

Метод «сэндвича» как вариант постановки ИФА

Наиболее распространенным неконкурентным методом является «сэндвич» метод. При его выполнении на твердой фазе иммобилизуют первичные антитела с их последующей блокировкой. Затем к ним прибавляют исследуемое вещество, содержащее антиген, и инкубируют. После инкубации комплекс антиген–антитело отмывают от несвязавшегося антигена и добавляют вторичные антитела, меченные ферментом, и проводят детекцию.

Конкурентный метод ИФА

Конкурентный метод ИФА подразделяется на несколько видов: по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный (непрямой) конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген или антитело).

Прямой конкурентный вариант ИФА

Для обнаружения или количественного определения растворимых антигенов применяют прямой конкурентный вариант ИФА с иммобилизованным на твердой фазе антигеном. Для этого используют антиген-специфические антитела, конъюгированные с соответствующим детектором (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, рутений или флуоресцеин). На твердую фазу иммобилизуют стандартный антиген с последующей блокировкой. Конъюгированное с ферментативной меткой антитело инкубируют с исследуемым веществом (растворимым антигеном). Затем эту смесь добавляют к иммобилизованному антигену, инкубируют, а потом отмывают от несвязавшегося комплекса антиген–антитело. Следующий шаг заключается в добавлении подходящего субстрата для используемого в качестве метки фермента. Ингибирование реакции, обусловленное наличием 2 антигенов в системе, по сравнению с контрольным образцом без конкурентного растворимого антигена, является обратно пропорциональным значению количества исследуемого вещества.

Выполнение прямого конкурентного варианта ИФА с иммобилизованным на твердой фазе антителом аналогично прямому конкурентному ИФА с иммобилизованным на твердой фазе антигеном, однако используется для обнаружения или количественного определения антител.

Косвенный (непрямой) конкурентный вариант ИФА

Этот способ постановки ИФА аналогичен прямому конкурентному варианту, однако вместо меченого антитела или антигена при детекции используется меченый анти-Ig реагент или меченые вторичные антитела, соответственно.

Общие условия проведения метода ИФА

В качестве твердой фазы для проведения иммуноферментного анализа применяют различные материалы: силикон, нитроцеллюлоза, полиамиды, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, акрил и другие. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и другие планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки. От выбора твердой фазы зависит принцип иммобилизации (гидрофобное, гидрофильное, ковалентное взаимодействие). Чаще других в качестве твердой фазы используют 96-луночные пластиковые планшеты для микротитрования. Количество лунок в планшете может варьироваться. Планшет может быть прозрачным (колориметрическая детекция) и матовым (хемилюминесцентная детекция, флуориметрия).

Иммобилизацию необходимо проводить без пузырьков воздуха в лунке, так как их присутствие изменяет показание оптической плотности. Возможно использование биотинилированных иммобилизованных реагентов. В этом случае в реакции используют стрептавидин и биотинилированную ферментативную метку. Данный метод используется для усиления сигнала. Время и температура иммобилизации, зависящие от кинетической природы, стабильности и концентрации реагента, должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации.

Все стадии иммуноферментного анализа, промывочные и блокирующие растворы, временные промежутки и температурные условия для каждой стадии, количество оборотов в минуту для инкубации на шейкере, условия детекции также должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации.

Примеры методик для некоторых видов ИФА

Косвенный неконкурентный метод ИФА

Сорбция антигена. В каждую лунку 96-луночного планшета вносят 0,1-0,5 мкг антигена и 100 мкл 0,05 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора (рН 9,6), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, и далее проводят сорбцию при температуре 4 О С в течение 16 ч. Возможно использование других буферных растворов с высокими значениями pH. Инкубация проводится при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка (двукратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0), содержащим 0,1 % твин-20 (по 300 мкл на лунку), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации.

Блокировка. Для блокирования мест неспецифического связывания антигенов или антител лунки планшета заполняют фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0) или другим буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или в нормативной документации, содержащим 1% раствор бычьего сывороточного альбумина или других белков (казеина, желатина, сухого молока и др.), и инкубируют в течение 10–15 мин при комнатной температуре (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации).

III. Титрование специфических антител. При необходимости количественной оценки исследуемое вещество (антиген или антитело) титруют в серийных разведениях параллельно со стандартным образцом (СО).

Титрование можно проводить как в горизонтальных, так и в вертикальных рядах планшета. Необходимо отметить, что титрование антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить их титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных антител (сыворотки) разведение.

При титровании в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител – в среднем 1–10 мкг на лунку, далее производят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфическими антителами проводят в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора pH 9,0, содержащего 0,1% твин-20.

Добавление антивидовых (антиглобулиновых) антител, конъюгированных с ферментной меткой. В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с ферментативной меткой. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc- фрагментам специфических антител. Концентрация детекторных антител, как правило, указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000).

Инкубация с вторичными мечеными антителами проводится в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (pH 9,0), содержащего 0,1 % твин-20.

Инкубация проводится в течение 10 мин при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Для остановки ферментативной реакции применяют «стоп реагент», который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве «стоп реагента» применяют серную кислоту.

Прямой неконкурентный метод ИФА

Методика прямого ИФА имеет лишь небольшие отличия от методики непрямого неконкурентного ИФА. Так, I и II стадии одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте ИФА на стадии III используют специфические исследуемому антигену антитела, конъюгированные с ферментной меткой, и они прямо взаимодействуют с исследуемым веществом. При необходимости также можно проводить титрование конъюгатов аналогично принципу, описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV в рамках прямого неконкурентного ИФА не проводится.

«Сэндвич» метод ИФА

В данном варианте ИФА используется пара антител (первичные и вторичные), специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

Сорбция антител на твердой фазе. Методика сорбции антигена аналогична методике сорбции антител в разделе «Косвенный неконкурентный метод ИФА».
Блокировка. Методика блокировки мест неспецифического связывания на подложке (твердой фазе) аналогична методике блокировки, описанной в разделе «Косвенный неконкурентный метод ИФА».

III. Инкубация с антигеном. В лунки планшета с преадсорбированными антителами вносят по 50 мкл исследуемого вещества и стандартных разведений антигена, если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе фосфатно-солевого буферного раствора (pH 9,0), содержащего 0,1 % твин-20, поскольку твин-20 снижает неспецифическое связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемое вещество, и стандартные разведения антигена вносят попарно в соседние в горизонтальном ряду лунки (либо по 3 повторности), используя по 2 (3) лунки на каждое разведение белка.

Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0), содержащим 0,1 % твин-20, или другим буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации.

Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфических антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител, как правило, указывается в фармакопейной статье или нормативной документации (обычно используют концентрацию 2–4 мкг/мл).

Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (pH 9,0), содержащего 0,1 % твин-20, или другим буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации.

Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта. Методика проведения ферментативной реакции аналогична методике, описанной в разделе: «Косвенный неконкурентный метод ИФА».

Детекция

Как было указано выше, для детекции используются меченные ферментной меткой или другим реагентом антитела. В качестве ферментной метки могут выступать, например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза или галактозидаза. В качестве детектора могут быть использованы антитела или антигены с другими метками. Выбор реагента-детектора зависит от типа метки, конъюгированной с антителом или антигеном и способа детекции.

В качестве методов детекции могут быть использованы спектрофотометрия, хемилюминесценция, флуориметрия и другие методы, исходя из выбора метки.

Результаты количественного метода ИФА

Результаты количественного метода ИФА рассчитывают по линейной калибровочной кривой с обратной регрессией или с помощью комплексного метода, использующего нелинейную калибровочную кривую с обратной регрессией. Методика интерпретации результатов зависит от используемого способа постановки ИФА. Например, по результатам испытания с помощью калибровочной кривой можно оценивать концентрацию неизвестного образца, проводить оценку полумаксимальной концентрации ингибирования или эффективной концентрации. Это позволяет определять количество исследуемого вещества или его активность в сравнении с эталонным/калибровочным стандартным образцом (СО). Обычно вид калибровочной кривой при выполнении количественного метода ИФА, характеризующий концентрацию анализируемого препарата, зависит от рассчитанного среднего значения нелинейно. В связи с этим, рекомендуется использовать различные математические модели для анализа полученной кривой. В остальных случаях метод ИФА используют как качественный метод, позволяющий оценить наличие того или иного исследуемого вещества в пробе в пределах чувствительности методики.

Примечание.

Приготовление карбонат-бикарбонатного буферного раствора (pH 9,6). В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл вносят 1,59 г натрия карбоната (безводного) или 4,29 г натрия карбоната 10-водного и 2,93 г натрия гидрокарбоната, растворяют в 800 мл воды очищенной, доводят pH до 9,6, перемешивают, далее доводят объем раствора до метки водой очищенной и вновь перемешивают.

– современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни. Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:

1) Поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;
2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);
3) исследование гормонального статуса пациента;
4) обследование на онкомаркеры;
5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).
2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.
3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:

1) Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя.

Основные понятия

Перед тем, как прояснить суть метода ИФА, кратко разберемся в некоторых понятиях.
Антитела (или иммуноглобулины - Ig) – специфические белки, вырабатываемые B -
лимфоцитами (иммунные клетки) в ответ на попадание в организм какого-либо инфекционного патогена (вирусы, бактерии, грибы и др). Выделяют иммуноглобулины А (IgA), иммуноглобулины Е (IgE), иммуноглобулины М (IgM), иммуноглобулины G (IgG), иммуноглобулины D (IgD). Отличаются они друг от друга молекулярной формой и массой, периодом полураспада, участием/неучастием в инфекционных процессах, сроками обнаружения с момента инфицирования. Если рассмотреть молекулярный вес, то больше всего он у IgM – это пентамер (950 000 дальтон) в отличие от остальных Ig (от 150 до 200 000 Да), благодаря чему IgM просто не могут проходить через плацентарный барьер. Поэтому обнаружение IgM у ребенка 1 года жизни всегда является признаком наличия инфекции у плода. В сыворотке крови основная масса иммуноглобулинов представлена именно IgG (75-85%), а самая низкая - IgE (0,003%). В инфекционном процессе непосредственное участие принимают только IgA, M, G. IgE являются признаком аллергических реакций и заболеваний, а IgD – можно обнаружить лишь в ткани лимфоузлов и миндалин, играет роль в формировании местного иммунитета.

Антигены – высокомолекулярные вещества органического происхождения, в частности возбудителей инфекционных и других заболеваний, а также вещества различных измененных клеток, образующихся при той или иной болезни (аутоиммунные заболевания, онкология).

Иммунный комплекс – комплекс антиген-антитело, участвующий в иммунном процессе.

На чем основан метод ИФА.

Выделяют несколько разновидностей ИФА (прямой, непрямой, метод блокирования, конкурентный), однако на практике чаще всего используется гетерогенный твердофазный иммунный анализ или ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

Простым языком этот процесс можно разделить на несколько этапов:

1) На поверхности лунок планшета доктора, проводящего обследование, находится очищенный антиген определенного возбудителя. При добавлении биологического материала (сыворотки крови) пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Это соединение будет выступать «особым антигеном» в следующем этапе.

2) На данном этапе идет образование ИК (иммунных комплексов) - реакция между «особым антигеном» и конъюгатом (это иммуноглобулин, меченый ферментом пероксидазой). Добавляется особый хромоген. Результатом такой ферментативной реакции является образование окрашенного вещества в лунке планшета, интенсивность окраски которого зависит от количества содержащихся в материале пациента иммуноглобулинов (антител).

3) Далее происходит оценка результата: фотометрирование с помощью многоканального спектрофотометра, сравнение оптической плотности исследуемого материала с оптической плотностью контрольных проб, математическая обработка результатов. Количество антител у пациента напрямую зависит от высоты оптической плотности данной лунки.

Обычно на практике используют 96 луночные планшеты.

При измерении оптической плотности (ОП) исследуемой жидкости подсчитывается количество (или концентрация) антител в определенной единице объема. Затем результат сравнивается с контрольным образцом.

Нужно помнить: для каждой тест-системы разрабатываются индивидуальные показатели для учета результатов, показатели нормы и патологии (то есть «референтные значения»). Это нужно учитывать при оценке результатов каждого конкретного исследования. Некорректно интерпретировать результаты одной лаборатории по «референтным значениям» другой лаборатории. Также некорректно сравнивать результаты разных лабораторий между собой.

При постановке реакций ИФА имеет значение и такое понятие как авидность антител.
Авидность антител – это прочность связи антитела с антигеном и то количество антигена, находящегося во взаимосвязи с иммноглобулинами (антителами). Авидность имеет большое значение при оценке предполагаемого срока инфицирования, что чрезвычайно важно при диагностике первичного инфицирования у беременных.

Основа теста на авидность антител состоит из обработки иммунного комплекса (антиген-антитело) раствором мочевины с целью разрушения белка. Высокоавидные связи остаются целыми, а низкоавидные разрушаются. Результат выдается в виде индекса авидности, выражаемого в процентах (%).

Какие заболевания выявляются с помощью ИФА-диагностики?

2. Маркеры аутоиммунных заболеваний и показатели иммунитета человека (общий IgE, общий IgG, общий IgA, общий IgM, общий IgD, секреторный IgA, IgG 2, IgG4, ЦИК-циркулирующие иммунные комплексы, IgA и IgG к глиадину и другие)

3. Онкологичсекие маркеры (ФНО – фактор некроза опухоли, РЭА – раково-эмбриональный антиген, ПСА – простатспецифический антиген, ХГ – хорионический гонадотропин, СА 125, альвеомуцин и многие другие)

4. Репродуктивные нарушени я (эстрадиол, прогестерон, пролактин, тестостерон, АФП- альфафетопротеин, ФСГ – фолликулостимулирующий гормон и другие)

5. Заболевания щитовидной железы (свободные и связанные Т3, Т4, тиреоглобулин, тиреопероксидаза – ТПО, тиреотропный гормон - ТТГ).

Данный список представлен далеко не всеми заболеваниями, которые диагностируются с помощью иммуноферментного анализа.

Материал для ИФА анализа и правила его забора

Наиболее распространенный материал для реакции ИФА – это сыворотка крови пациента, взятая натощак. Материалом также могут служить спинномозговая жидкость, околоплодные воды, содержимое стекловидного тела, слизь цервикального канала и уретры, мазки.

Подготовка пациентов к сдаче материала для ИФА

Сроки изготовления ИФА

Иммуноферментный анализ материала проводится быстро, в течение суток. Задержки могут быть в разных лабораториях из-за накопления определенного количества сывороток.

Возможные результаты ИФА-диагностики

При оценке результатов на конкретные инфекции имеет значение класс обнаруженных антител и их количество. От этого зависит не только вопрос этиологии инфекции (есть она или нет), но и предполагаемая стадия заболевания (острая, хроническая), а также наличие активной инфекции (острой или обострения хронической) на момент обследования.

Каковы приблизительные сроки появления антител (иммуноглобулинов - Ig)?

Самыми ранними антителами являются IgM . Выявить их можно через 1-3 недели после возможного инфицирования, что характеризует острую фазу инфекционного процесса. Вторая ситуация появления антител IgM – активация (или обострение) хронического процесса. Антитела IgM циркулируют в среднем около 3х месяцев, затем их количество постепенно исчезает. Однако у некоторых пациентов следовые количества IgM могут обнаруживаться в течение 1-2х лет с момента инфицирования.

Современные тест-системы обладают высокой чувствительностью, вследствие чего встречаются неспецифические ложноположительные результаты (нередко у беременных). Поэтому у данной группы пациентов положительные IgM нужно перепроверять!

Антитела IgA появляются через 2-4 недели после инфицирования, но в количестве, достаточном для обнаружения – через месяц. Сывороточные IgA синтезируются плазматическими клетками селезенки, лимфоузлов и слизистых оболочек,Секреторные IgA концентрируются на слизистых оболочках для выполнения своей защитной функции – участвуют в местном иммунитете.

С 4й недели после инфицирования начинают появляться антитела IgG . При большинстве инфекций титр их постепенно увеличивается с максимумом в разные сроки (в среднем через 1,5-2 мес), далее титр остается на невысоком уровне и указывает на иммунитет. При некоторых заболеваниях (микоплазмоз, хламидиоз, трихомониаз) уровень IgG не бывает высоким, снижается существенно из-за отсутствия иммунитета при данных инфекциях.

Варианты обнаружения антител разных классов:

Изолированное обнаружение антител IgM предполагает наличие первичного
инфицирования.
- Одновременное выявление в крови IgM и IgG характерно для первичного инфицирования
в предыдущие 2-3 месяца, а также при обострении хронического заболевания. Следовательно, при беременности наличие IgM не всегда является признаком первичного инфицирования.
- Выявление изолированно IgG может указывать как на иммунитет к данному заболеванию,
так и на хроническую инфекцию. Во второй ситуации имеет значение и количество антител (титр), и изменение этого титра в динамике. Обычно исследования проводят с интервалом в 2-4-6 недель.
- Обнаружение IgA изолировано или с IgM указывают на первичную инфекцию. При
появлении IgA вместе с IgG предполагается активация хронической инфекции (в среднем 2 недели от момента обострения).

Определение авидности антител IgG является прекрасным дополняющим этапом диагностики первичной инфекции от давнего заражения, что имеет свое клиническое значение, прежде всего, при оценке риска внутриутробного заражения плода. Обнаружение низкоавидных IgG указывает на первичную инфекцию и выявляются в среднем спустя 4-6 месяцев после инфицирования, реже дольше. Низкоавидные IgG требуют других лабораторных подтверждений первичного инфицирования (IgM). Высокоавидные антитела являются либо признаком хронического заболевания и его обострения, либо сформировавшегося иммунитета.

Особенности у детей грудного возраста: у детей до года, а иногда и 1,5 лет в крови циркулируют материнские IgG к разным инфекциям (то есть произошло их проникновение через плаценты от матери к плоду в период внутриутробного развития). Она не являются сами по себе признаком наличия инфекции в настоящем. Если же в такjм возрасте обнаруживаются IgM (напомним, что материнские IgM проникнуть через плаценту не могут), то это признак внутриутробного инфицирования или приобретенной после рождения инфекции.

Количественный ИФА-метод

Результат ИФА-диагностики (с помощью иммуноферментного анализатора) выдается в определенных единицах измерения:
- Оптическая плотность (ОП) пробы – концентрация специфических антител в единице объема. Чем выше ОП пробы, тем выше концентрация антител. В некоторых результатах говорится о коэффициенте позитивности (КП) – это тоже оптическая плотность образца.
- Единицы концентрации антител (нанограмм/ миллилитр или нг/мл).
- В виде титров сывороток: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 и так далее. Диагностические титры (при которых ставится диагноз именно болезни, а не факт инфицирования) для разных болезней разные.
- В виде символов – «+», «-», «?» (+, ++, +++, ++++).
- В виде качественной оценки по заданному критерию (положительно или отрицательно).

Правильно оценить количество антител, вариант классового выявления иммуноглобулинов, а, следовательно, выставить стадию болезни и необходимость лечения может только врач.

Нельзя забывать, что для любой тест-системы разрабатываются свои «референтные значения» (варианты нормы), при превышении которых и диагностируется то или иное заболевание (варианты патологии). Для разных тест-систем «референтные значения» различные.

Корректное сравнивание результатов ИФА, взятых в динамике, возможно только в случае их изготовления в одной и той же лаборатории.

Врач инфекционист Быкова Н.И.

THE BELL