И.П. Шабалова, Т.В.Джангирова, Н.Н.Волченко, К.К.Пугачев
Российская медицинская академия последипломного образования
Материалом для цитологической диагностики может быть:
- пунктах молочной железы;
- отпечатки с биоптата;
- соскоб с ткани молочной железы (или опухоли), удаленной во время операции;
- выделения из соска (метод практически неэффективен для диагностики злокачественных новообразований молочной железы, за исключением внутрипротокового рака);
- материал, полученный с эрозивных поверхностей.
Для диагностического заключения по цитологическим препаратам важно получение полноценного материала: он должен быть взят не из окружающих тканей, а из очага поражения. Трудности могут отмечаться при выраженном фиброзе или наличии кистозно измененных участков, в таких случаях нужно пытаться получить материал из разных участков опухоли, из стенок кисты; при некротических изменениях - стараться брать материал из периферии опухоли.
Получение материала
Пункционный материал
При проведении диагностической пункции необходимо соблюдать ряд правил:
- Игла и шприц для пункции должны быть абсолютно сухими.
- Не следует проводить анестезию пунктируемого образования в связи с тем, что сама пункция обычно не более болезненна, чем прокол иглой для анестезии, кроме того, применение новокаина может вызвать изменение клеточных элементов.
- Мандреном, как правило, не пользуются, так как иглы, применяемые для диагностических пункций, имеют очень маленький диаметр и косой срез; игла легко продвигается через ткани, расположенные над пораженным участком (кожу, подкожную клетчатку, мышцы), расслаивая их, поэтому закупорка иглы происходит очень редко.
- Нельзя пунктировать опухоль при подозрении на меланому.
- Пункцию выполняют с соблюдением правил асептики и антисептики.
Техника выполнения пункции
Пункцию проводит лечащий врач или врач клинической лабораторной диагностики в процедурном кабинете, иногда - в больничной палате (в зависимости от тяжести состояния больного). Если требуется контроль за положением иглы (опухоль небольших размеров, образование с кальцинатами и проч.), пункция выполняется под рентгенологическим контролем или под контролем ультразвукового исследования, компьютерной томографии и других методов в соответствующем кабинете.
Перед проведением пункции участок поражения тщательно пальпируют, определяют его подвижность, связь с окружающими тканями и возможность оптимальной фиксации. Опухоль фиксируют пальцами левой руки (если пунктирующий врач - правша).
Опухоль при пальпации кажется расположенной более поверхностно, чем на самом деле, поэтому угол направления иглы при аспирационной пункции не должен быть перпендикулярен к ребрам. Это особенно важно соблюдать при маленькой молочной железе, в которой опухоль может находиться близко к грудной стенке, и игла может попасть в ребро. Если игла попадет в ребро, в мазках можно обнаружить элементы костно-мозгового кроветворения (мегакариоциты, бластные клетки, миелоциты, эритробласты и проч.).
Пункцию производят тонкой иглой (наружный диаметр 0,6-0,7 мм), которая присоединяется к шприцу 10-20 мл. Иглу без шприца (или с присоединенным шприцем с опущенным поршнем) вводят через кожу в исследуемое образование под небольшим углом к грудной стенке. По достижении очага поражения осторожно пальпируют ткань вокруг введенной иглы, определяя правильность прокола; при небольшом подкожном узле можно несколько наклонить иглу, при этом опухоль на игле сместится, что ощущается пальцами и подтверждает правильное ее положение. Не рекомендуется производить вращательные движения иглой, так как это наносит лишнюю травму, не приводя к получению более полноценного материала. После этого присоединяют шприц с опущенным поршнем (если он не был присоединен сразу) и делают два-три резких насасывающих движения, снимая шприц с иглы после каждого подъема поршня. По окончании взятия шприц необходимо снять, иглу извлекать без шприца, что позволяет сохранить материал; для цитологического исследования обычно достаточно материала, попавшего в просвет иглы.
Содержимое иглы выдувается на предметное стекло (или в контейнер со специальным консервирующим раствором для жидкостной цитологии) при помощи шприца, который наполняется воздухом и вновь соединяется с иглой. Материал распределяется по стеклу краем шлифованного стекла или ребром иглы (см. ниже раздел "Приготовление препаратов").
Если при проколе опухоли появляется жидкость, то под иглу подставляют пробирку и собирают жидкость. Если она не стекает, можно использовать шприц, осторожно оттягивая поршень и набирая жидкость в шприц, после чего шприц снимают и его содержимое сливают в пробирку. После удаления всей жидкости и помещения ее в пробирку (с добавлением нескольких кристаллов цитрата натрия) обязательно следует тщательно пальпировать участок, из которого была удалена жидкость, для исключения остаточных масс, которые могли быть скрыты кистозным содержимым. Необходимо дополнительно пунктировать стенку кисты и приготовить мазки из этого материала.
Если при пункции получена жидкость, вся она должна быть доставлена в лабораторию.
Биопсийный материал
Цитологические препараты можно делать из материала, полученного при биопсии (столбика ткани):
- отпечатки выполняются путем аккуратного перемещения биоптата иглой по стеклу; при этом нужно стараться не травмировать биопсированный кусочек.
Операционный материал
Разрез уплотнения, опухоли или лимфатического узла необходимо проводить сухим скальпелем, чтобы избежать разрушения клеток водой.
- Операционный материал получают, прикладывая стекло к разрезу удаленной опухоли или другого участка поражения.
- Если консистенция ткани плотная, что не позволяет сделать отпечатки, производят соскоб с поверхности свежего разреза опухоли (путем легкого соскабливания скальпелем или краем предметного стекла с последующим приготовлением препарата)
Отделяемое из молочной железы
Для приготовления препарата капля отделяемого из молочной железы наносится на стекло и готовится мазок.
Если отделяемого немного, для получения мазков необходимо сцеживающими движениями, надавливая большим и указательным пальцами в области околососковой зоны, получить капли выделений из соска.
Мазки-отпечатки с эрозированных поверхностей
К месту поражения прикладывается предметное стекло, на котором остается некоторое количество клеточных элементов и отделяемого.
Материал можно брать также с помощью ватного тампона и наносить на предметное стекло в виде отпечатков.
Маркировка, доставка и обработка материала в цитологической лаборатории
Цитологический материал доставляют в лабораторию в ближайшие сроки после его получения. Особенно это относится к содержимому кист и любому кровянистому материалу.
Для доставки необходимо иметь специальные контейнеры для предметных стекол, пробирки. Не допускается контакт нативного материала, в том числе подсушенного предметного стекла, с бланком-направлением.
Полученный материал доставляют в лабораторию с бланком-направлением, в котором должны быть представлены паспортные данные обследуемой пациентки, диагноз, проведенное лечение, точно должна быть указана локализация участка, откуда был взят материал, и способ его получения.
Лаборант, который принимает материал, должен проверить маркировку препаратов, пробирок и т. д., оформление направления, отметить характер и количество биоматериала, число присланных мазков.
Приготовление препаратов
Правила приготовления препаратов едины вне зависимости от того, делается мазок специалистом, получившим материал, или готовится в лаборатории.
Стекла для препаратов нужно использовать новые, стандартного размера, чистые, обезжиренные и сухие.
Хороший мазок должен быть максимально тонким (максимально приближающимся к однослойному), равномерной толщины (не волнообразным) на всем протяжении. Материал распределяется по стеклу краем шлифованного стекла или ребром иглы.
Мазок должен начинаться на 1 см от узкого края предметного стекла и заканчиваться примерно в 1,5 см от другого края; мазок не должен достигать широкого края стекла, между мазком и широким краем предметного стекла должно оставаться расстояние не менее 0,3 см.
Жидкости, полученные при пункции, тут же центрифугируют, сливают верхний слой центрифугата, а из осадка делают мазки с помощью специального шлифованного стекла или пластинки (методика приготовления препаратов аналогична мазкам крови). При этом получаются тонкие препараты со щеточкой по краю для цитологического исследования.
Жидкостная цитология
- Лучшим способом обработки материала для цитологического исследования является жидкостная цитология. Препараты, приготовленные на цитоцентрифуге, однослойные, материал распределен равномерно на определенной поверхности.
- Препараты удобно просматривать, так как материал распределен равномерно.
- При необходимости проведения иммуноци-тохимических исследований экономятся дорогостоящие реактивы, результаты удобно интерпретировать
Фиксация и окрашивание препаратов
Мазок отпечаток – исследование, о котором, в отличие от стандартного мазка, слышали далеко не все. Сегодня этот способ диагностики активно применяется , гинекологами, урологами, онкологами. А также некоторыми другими специалистами.
Как проводится взятие мазков отпечатков, интересуются пациенты у своих лечащих врачей.
Какие есть разновидности этого анализа?
Как правильно подготовиться к взятию отпечатка и как проводится расшифровка?
- Мазок отпечаток: особенности забора материала
Мазок отпечаток: что это за исследование
Многие пациенты часто интересуются о том, что это такое – исследование мазков отпечатков, и в чем особенности этого исследования. На самом деле исследование выполняется довольно просто. Все, что необходимо сделать – это приложить к предметному стеклу орган, который необходимо исследовать. Затем, когда отпечаток будет получен, окрашивают полученный материал специальным раствором и изучают с помощью микроскопа.
Интересно, что мазки отпечатки применяют не только для постановки диагнозов в медицинской сфере. Их широко применяют в судебно-медицинской экспертизе, микробиологии, патологической анатомии. Широко применяться подобное исследование стало только в последние годы. Да и то до сих пор далеко не все пациенты знают, что подразумевается под этим анализом.
Как правильно подготовиться к нему и какие бывают разновидности обследования.
Разновидности мазка отпечатка
Сегодня выделяют несколько вариантов забора мазка отпечатка. Пациенты спрашивают у своих врачей, какие есть разновидности исследования.
Вариантов несколько:
Исследование может быть применено, чтобы диагностировать различные инфекции на половых органах. Его выполнение рекомендуется при различных подозрениях на инфекционные процессы как специфического, так и неспецифического типа. Исследование с язвы может выполняться, например, при . При этой патологии на половом органе, особенно у мужчин появляется неприятная, болезненная язва. С нее и берется отпечаток, чтобы потом при темнопольной микроскопии обнаружить бледных трепонем.
Еще один вариант диагностики – это обнаружение заражения герпесом. Особенно он эффективен после того, как образуются эрозии после прорыва папул.
- Мазок отпечаток головки члена
Отпечаток рекомендуется выполнять мужчинам, которые страдают от неспецифических инфекций. Особенно часто его стоит проводить при баланопостите или баланите. С помощью исследования можно выявить неспецифичные патогены, такие как кокковая палочка, кишечная палочка, грибки.
- Мазок отпечаток с эрозии шейки матки
Женщинам рекомендуют сдавать анализ в том случае, если у них есть эрозия на шейке матки. Это необходимо чтобы убедиться, что в органе нет признаков злокачественного перерождения. Если такие признаки обнаруживаются, представительнице прекрасного пола рекомендуется обратиться к онкологу.
Показания к выполнению мазка отпечатка
Мазок отпечаток головки, с шейки матки или иных частей может выполняться по различным показаниям. Чаще всего врач направляет пациента на это исследование в том случае, если есть подозрение на инфекционный процесс.
Симптомы, с которыми больной может получить направление на анализ, следующие:
Всем хорошо известно, что мазок из уретры – болезненная процедура для представителей сильного пола. У женщин эта процедура проходит несколько легче, но все равно неприятна. Мазок отпечаток отличается от мазка из уретры полной безболезненностью выполнения.
Правда, к сожалению, показания для выполнения этих процедур не одинаковы, а потому заменить одну другой чаще всего нельзя.
Техника выполнения очень проста. Мужчину просят раздеться ниже пояса. Затем с помощью специальной щеточки собирают биологический материал. Особенно важно собрать достаточное количество материала, но при этом не переборщить.
Если материала будет недостаточно, нельзя будет получить хоть какие-то результаты. Избыток же биоматериала может привести к получению ложноположительных или ложноотрицательных результатов.
Полученный с помощью щеточки биологический материал наносят на предметное стекло. И закрепляют специальными методами для исследования с помощью микроскопа. Либо помещают в специальную пробирку.
Пробирку или стекло направляют в лабораторию, где проводятся дальнейшие исследования по необходимости. В качестве аналогии забора материала щеточкой можно приложить половой член к предметному стеклу или аккуратно собрать предметным стеклом выделения. Но, как считают врачи, использование щеточки – более правильный вариант.
Как готовятся мазки отпечатки
Приготовление мазка отпечатка – задача, которую должен выполнять грамотный врач или лаборант. Дело в том, что мало просто нанести биологический материал на предметное стекло. Его необходимо еще и правильно зафиксировать.
Если биоматериал не будет зафиксирован, то исследовать его с высокой степенью достоверности не удастся. Для окраски могут использоваться различные красители. Чаще всего применяют окраску по Граму. С ее помощью выявляют нормальную и патологическую микрофлору, которая может наносить пациенту вред.
Правда, стоит иметь в виду, что отпечаток не позволяет выявить вирусы, так как окрасить их невозможно. Зато с помощью этого диагностического метода можно обнаружить не только патогенные микроорганизмы, но и . Чаще всего диагностируется кандида.
Мазок отпечаток: базовые правила подготовки
Ни мужчине, ни женщине нельзя прийти на обследование и сразу получить достоверные результаты, сдав анализ просто так. Необходимо провести минимальную подготовку, которая позволит получить достоверные данные.
Если подготовка будет проводиться правильно, то результаты удастся получить наиболее точные и достоверные. Если же пациент нарушит рекомендации, велика вероятность того, что ему придется проходить диагностическое исследование повторно. Так как врач сможет поставить их достоверность под сомнение.
Расшифровка результатов мазка отпечатка
Расшифровка результатов мазка отпечатка должна проводиться врачом. Только медицинский работник сможет достоверно оценить результаты. Ориентируясь не только на то, что написано в справке, но и на то, как себя ощущает пациент. По сути, только благодаря врачу можно отделить достоверные результаты от ложноположительных и ложноотрицательных.
При оценке результатов в первую очередь обращают внимание на:
- наличие в мазке бактерий, которые могут быть как патогенными, так и нормальными;
- обнаружение в результатах патогенных грибков, которые могут негативно влиять на здоровье пациента;
- наличие эпителия, слизи и других частиц, которые могут оцениваться как положительно, так и отрицательно.
Пациентам не рекомендуется самостоятельно проводить расшифровку анализов даже в том случае, если кажется, что сделать это можно легко. Необходимо принести полученные результаты врачу. Чтобы он оценил итоги и, опираясь на них и объективные данные от исследования, мог поставить точный диагноз.
Мазок отпечаток: что делать, если результаты плохие
Если результаты мазка отпечатка оказались плохими, в первую очередь пациент не должен впадать в панику. Необходимо, посетив врача, получить от него направление на повторный анализ. При положительных результатах необходимо обязательно перепроверять итоги.
Чтобы исключить ложноположительные варианты поставки диагноза. Далее, после того как будут получены повторные результаты, если они все еще положительны, нужно обратиться к врачу.
Медицинский работник сможет:
- дать рекомендации относительно прохождения дополнительных исследований, чтобы поставить окончательный диагноз;
- дать рекомендации относительно правильного лечения заболевания;
- проконтролировать ход терапии и назначить контрольную диагностику, чтобы понять, насколько в итоге эффективно лечение;
- при необходимости поменять подход к лечению, чтобы получить надежные результаты.
Если у пациента выявлены инфекции, передающиеся половым путем, это может грозить нарушением репродуктивной функции. Именно бесплодие в основном заставляет людей обращаться к врачу для проведения диагностики. В которую, в том числе, может входить и выполнение мазка отпечатка.
Часто пациенты интересуются, где можно сдать цитологию мазка отпечатка или пройти альтернативу этому исследованию. Обратиться можно как в государственный кожно-венерологический диспансер, так и в частную клинику при необходимости. Сдать биоматериал на исследование можно на бесплатной основе. Если проходить диагностику по месту жительства по рекомендации врача. Также и платно.
Сдача мазка отпечатка – это хороший диагностический метод, позволяющий поставить диагноз во многих случаях. Если же этого подхода будет недостаточно для определения болезни, врач сможет после оценки результатов подобрать наиболее оптимальные варианты уточняющей диагностики. А затем выбрать способы терапии, которые дадут положительный эффект, а также проконтролировать ход лечения.
При необходимости сделать мазок отпечаток обращайтесь к грамотным венерологам и гинекологам.
Автор (ы):
Ян Рыбничек, MVDr, Diplomate European College of Veterinary Dermatology
Организация(и):
Dermatology and Dermatopathology Service, Czech Republic
Журнал:
№2 - 2013
Большинство болезней кожи имеют сходную клиническую картину, однако можно выделить девять основных групп характерных дерматологических нарушений:
– алопеция
– образование чешуек/корок/себорея
– макулы/папулы/вскрывающиеся пустулы
– узлы/опухоли
– изменения пигментации
Как только врач-клиницист начнет относить каждого пациента к какой-либо из перечисленных выше категорий, ему станет намного проще формировать список дифференциальных диагнозов и разрабатывать диагностический план. Необходимо помнить, что у пациента могут быть сопутствующие болезни в настоящий момент времени, которые затрудняют постановку основного диагноза.
Быстрая постановка диагноза часто представляет значительные трудности для практикующего врача, поэтому далее речь пойдёт о доступных методах лабораторного исследования, требующих минимальных затрат времени и средств. Наиболее простые и быстрые диагностические тесты, используемые на практике:
– Соскобы кожи
– Трихоскопия
– Вычёсывание гребнем или щёткой
– Скотч-тест
– Исследование на дерматофиты
– Цитология кожи
Кожные соскобы
Данное исследование должно проводиться во всех случаях! Для проведения кожных соскобов необходимо следующее оборудование и материалы: минеральное масло, предметные стёкла, лезвие скальпеля или шпатель (кюретка), микроскоп.
Исследование в лучах лампы Вуда – крайне неспецифично, однако при выявлении флюоресценции, пораженные волоски выщипываются и подвергаются дальнейшему исследованию (микроскопии после обработки препарата раствором щёлочи, посев для выявления культуры дерматофитов). На предметное стекло наносят 10% раствор КОН, размещают удалённую шерсть, нагревают над пламенем, проводят микроскопию, предварительно накрыв покровным стеклом, сначала под малым увеличением (объектив 10х), затем под большим (объектив 40х). Для лучшей визуализации можно использовать окраску хлорлактофенолом.
Скотч-тест
Для получения материала для цитологии необходимо коротко подстричь шерсть с выбранного участка, плотно прижать полоску скотча, затем её поочерёдно опускают в растворы красителей, приклеивают на предметное стекло и проводят микроскопию. Этим методом легко выявляются дрожжевые грибы рода Malassezia в форме «матрёшки», бактерии рода Simonsiella (свидетельствует о попадании слюны при вылизывании) и др.
Трихоскопия
При микроскопии обращают внимание на структуру и пигментацию стержней волос, осматривают кончики волос, оценивают трихограмму (соотношение волос в разных фазах цикла фолликула: анаген/телоген). Анаген – стадия роста, корень удалённого волоса мягкий, приобретают округлую форму («ручки от зонта»). Катаген – промежуточная стадия, рост волоса прекращается, корень имеет форму кисти, окруженной стекловидной оболочкой. Телоген – стадия покоя волосяного фолликула, корень волоса теряет пигмент, сужается к концу в форме «художественной кисти», приобретает вид «копья». Различают первичные и вторичные волосы (в норме). Утрата первичных волос может быть одним из диагностических критериев при некоторых алопециях (например, при алопеции Х). Стержни первичных волос большего диаметра, мозговое вещество всегда толще коркового. Вторичные волосы меньшего диаметра, часто волнистые, мозговое вещество тоньше коркового.
Строгих норм для трихограммы не существует, однако есть наблюдения, описывающие соотношение анаген/телоген 1:9 зимой и 1:1 летом у некоторых собак. Существуют породные особенности - у собак с постоянно отрастающей шерстью (например, пудели) преобладают фолликулы в стадии анагена независимо от времени года, а у собак северных пород может наблюдаться выраженная телогенизация луковиц.
Наличие всех 100% волос в стадии телогена в большинстве случаев не является нормой, может быть обусловлено неправильным взятием пробы, гормональными нарушениями, алопецией Х, телогеновой алопецией. Гормональные факторы оказывают влияние на цикл волосяного фолликула и сопровождаются телогенизацией, из-за задержки в цикле волосяного фолликула волосы постепенно подвергаются процессу старения (чёрная шерсть приобретает красноватый оттенок, рыжая – обесцвечивается, кончики могут расщепляться). Первичный волос исчезает, задержавшийся подшерсток имеет вид щенячьей шерсти. Эндокринными причинами таких алопеций могут быть гипотиреоз, гиперэстрогенизм, гиперкортицизм. Неэндокринной причиной является синхронизация всех волос в телогене, вызванная тяжёлой болезнью или стрессом. Как только волос возобновляет свой рост, через 1-2 месяца наступает ремиссия. Алопеция Х является болезнью с невыясненной до конца этиологией.
Структурные нарушения корней волос возникают вследствие фолликулярной дистрофии или дисплазии. В редких случаях это может быть связано с повреждением гранулами пигмента. Также корни волос повреждаются при очаговой алопеции и воздействии цитотоксических лекарств (редко).
Обращают внимание на кончики волос: в норме они имеют заострённую форму, а при алопеции вследствие вылизывания наблюдаются признаки травматизации кончиков волос (они могут быть обломанными). Кончики волос могут повреждаться из-за повышенной хрупкости, вызванной структурными изменениями. Например, отмечено появление раздвоенных кончиков волос при трихофитозе у гольден-ретриверов. Патологические изменения кончиков волос могут быть следствием чрезвычайно агрессивного мытья и расчёсывания шерсти, а также механического повреждения в местах повышенного трения.
При оценке стержня волоса можно обнаружить споры дерматофитов. При правильном выполнении трихоскопия даёт положительный результат в 60-70% случаев дерматофитоза. Предпочтительнее исследовать волосы, флюоресцирующие в лучах лампы Вуда. Структура стержня волоса нарушается не только при дерматофитозе, но и в ряде других случаев, например, химиотерапии (редко), механической и химической травме (агрессивный уход), недостатке питательных веществ, наследственных болезнях (узловой трихорексис и др.). Характерные изменения структуры стержня волоса наблюдаются при медуллярной трихомаляции немецких овчарок, проявляющейся у взрослых собак. Шерсть выглядит подстриженной на теле, хвосте, плече-лопаточной области. При трихоскопии в стержнях волос наблюдаются продольные трещины, разрывы. Характерные изменения отмечаются при алопециях, связанных с нарушением продукции меланина – алопеции «ослабленного» окраса и фолликулярной дисплазии чёрных волос. «Обесцвечивающей алопеции» подвержены собаки с голубым и светло-коричневым окрасами. При данной болезни в волосе с ослабленным цветом обнаруживаются крупные гранулы пигмента, которые вызывают повышенную ломкость волоса, что приводит к алопеции. Фолликулярная дисплазия чёрных волос наблюдается у двух- и трёхцветных собак, при этом поражаются только фолликулы чёрных волос. Щенки рождаются нормальными, но впоследствии зоны тёмных волос постепенно подвергаются алопеции. При трихоскопии выявляются аномальные глыбки меланина в стержне волоса.
При трихоскопии можно легко обнаружить агрегаты кератина в виде слепков волосяных фолликулов на стержне волос. Они возникают вследствие дефектов кератинизации (первичная себорея кокер-спаниелей, дерматоз при недостатке витамина А, аденит сальных желёз, лейшманиоз, демодекоз), а также при других фолликулярных болезнях, например, бактериальном фолликулите.
Цитология кожи
Цитология кожи – быстрый, неинвазивный метод, имеющий большую диагностическую ценность. Данный вид исследования особенно ценен для диагностики нодулярных, экссудативных, гнойничковых поражений, при образовании корок и себорее, а также при отитах. При нодулярных поражениях предпочтительнее получение материала путём тонкоигольной аспирации при помощи шприца объёмом 10 мл с иглами 21G, 24G. При мокнущих поражениях можно проводить исследование мазков-отпечатков. Также цитологическому исследованию подвергают скотч-препараты, и, конечно, глубокие соскобы. Препараты высушивают на воздухе, можно использовать фиксацию метанолом. Я использую модифицированный краситель Райта (Diff-Qick), в лабораториях также проводят окраску специальными красителями, иммуноцитохимию. Просмотр препаратов проводят последовательно с использованием объективов 4х, 10х, 40х, 100х (с иммерсионным маслом).
В соскобе с нормальной кожи преобладают корнеоциты, присутствуют также другие кератиноциты, единичные фибробласты. При цитологическом исследовании материала с воспалённых участков обращают внимание на следующие клетки:
– Нейтрофилы (дегенеративные и недегенеративные);
– Макрофаги;
– Лимфоциты/плазматические клетки;
– Эозинофилы и тучные клетки;
– Акантолитические клетки (округлённые кератиноциты, лишённые отростков);
– Неопластические клетки.
Также можно обнаружить микроорганизмы (палочки, кокки, малассезию, другие грибы, лейшмании и др.).
Я использую следующие основные критерии цитологической дифференциальной диагностики:
– Бактерии и эпителиальные клетки – бактериальный перерост;
– Дегенеративные нейтрофилы и бактерии – пиодермия;
– Недегенеративные нейтрофилы в большом количестве + акантолитические клетки – листовидная пузырчатка, эритематозная пузырчатка и др. (дополнительно + гистопатология);
– Нейтрофилы + макрофаги – пиогранулёма/гранулёма (грибковая, атипичная бактериальная инфекция);
– Лимфоциты, плазматические клетки – хроническое воспаление, плазмацитарный пододерматит, лимфома (дополнительно + лимфобласты);
– Malassezia sp. и эпителиальные клетки – малассезиозный дерматит.
При оценке морфологии клеток принято оценивать следующие признаки злокачественности:
– Цитоплазматические критерии (анизоцитоз, макроцитоз, разная интенсивность окраски (степень базофилии), атипичные включения /вакуолизация, отсутствие специфичных гранул, большое ядерно-цитоплазматическое соотношение, а также наличие в препарате клеток, значительно различающихся по этому параметру);
– Ядерные критерии (анизокариоз, макрокариоз, изменение формы ядер, разреженный хроматин или гиперхромазия, анизохромазия, высокий митотический индекс, неправильные митозы, множественные ядрышки, гигантские ядрышки, патологическая форма ядрышек).
При исследовании цитологических препаратов нодулярных поражений надо ответить на следующие вопросы:
– Воспаление/опухоль;
– Неоплазия – доброкачественная/злокачественная;
– Источник неоплазии;
– Происхождение ткани: эпителиальные, мезенхимальные, гемопоэтические (круглоклеточные) опухоли.
Наиболее частыми цитологическими дифференциальными диагнозами опухолевых поражений кожи в практике являются:
– Эпителиальные опухоли (кератоакантома, плоскоклеточный рак и другие);
– Мезенхимальные опухоли (фибросаркома, меланома и др.);
– Круглоклеточные опухоли (мастоцитома, гистиоцитома, лимфома);
В связи с ростом доступности гистопатологии в последние годы значительно выросла возможность диагностики различных дерматологических патологий. Несмотря на это, пока достаточно редко прибегают к взятию гистобиоптатов ввиду возможности получения малоинформативных результатов. Поэтому дальнейшая информация посвящается оценке необходимости взятия гистобиопсии кожи, правильному выбору участка кожи для гистологического исследования, корректному забору образца, выбору патогистолога и интерпретации гистологического заключения. Только при соблюдении всех этих условий, можно получить точный диагноз.
1) Гистобиопсия обычно не применяется для диагностики у собак с хроническим зудом. В большинстве случаев, результаты биопсии не дадут той информации, которую может получить специалист-дерматолог при клиническом обследовании.
2) Гистобиопсия кожи может быть полезна в следующих случаях:
– Алопеция, когда не удается поставить диагноз с использованием «быстрых» методов диагностики (т.е трихоскопии, кожных соскобов, цитологии…)
– Шелушение, когда не удается поставить диагноз с использованием «быстрых» тестов
– Пятна, папулы, вскрывающиеся пустулы, когда не удается поставить диагноз с использованием «быстрых» тестов
– Незаживающие эрозии, язвы, свищи
– Длительно существующие узлы, уплотнения, опухоли
– Депигментация и необычная гиперпигментация
– Подозрение на аутоиммунные болезни
– Подозрение на болезни кожи, при которых подтверждение диагноза возможно только гистологически (например, аденит сальных желёз)
– Случаи, когда подозревается опасный для жизни диагноз (дерматомиозит и др.)
– Случаи, когда отсутствует ответ на вполне рациональное лечение
Как получить качественные гистобиоптаты кожи
Чтобы получить понятный правильный гистологический диагноз, следует выполнять следующие действия:
1) Выбор участка для биопсии
Необходимо представить патологу соответствующие образцы, поэтому клиницист должен уделить внимание выбору нужного участка кожи. В большинстве случаев, для более вероятного получения правильного диагноза необходимо взять как минимум 3-5 образцов кожи от одного пациента. Выбор места для биопсии зависит от типа обнаруженных поражений:
– Алопеция: биоптаты должны быть получены с участка полностью облысевшей кожи (желательно 2), на границе нормальной кожи и области алопеции (1) и с кожи, покрытой нормальной шерстью (если такой имеется), чтобы патолог мог сопоставить физиологические волосяные фолликулы и фолликулы из области патологического процесса данного пациента.
– Шелушащиеся поражения («себорейная» кожа): берётся 2-3 биоптата с поражённого участка и образец нормальной кожи (1), чтобы была возможность сравнить эпидермис, особенно роговой слой в этих участках. Можно использовать биопсийную иглу для получения образцов.
– Макулы, папулы, пустулы: в результате биопсии должны быть получены образцы как минимум с трёх участков первичных поражений, которые должны располагаться в центре биоптата. Можно использовать биопсийную иглу для получения образцов.
– Изъязвлённые участки: это наиболее сложный для биопсии тип поражений. Основной ошибкой является направление патологу биоптата из центра язвы с последующим получением ответа «язва» без какого-либо специфического диагноза. В ситуации, когда материал получен из центра большой язвы, гистологическая картина будет характерна для инфекционного процесса. Приходится также брать несколько образцов, чтобы патолог мог связать процессы, происходящие в язве, и в нормальной коже. Если присутствуют небольшие язвы, можно отправить на исследование всю эту зону целиком, включая ободок здоровой ткани.
– Свищи: обычно патологический процесс расположен глубоко в дерме, а зачастую и под кожей, поэтому нужна очень глубокая биопсия для выяснения природы патологического процесса. В таких случаях лезвием скальпеля проводят иссечение клиновидного биоптата, с помощью биопсийной иглы при таком типе поражений невозможно получить информативный образец. В то же время, имеет смысл биопсийный материал направить на бактериологическое, микологическое исследование.
– Уплотнения и узлы: опять хирургическая эксцизия всего узла с прилегающими нормальными тканями является методом выбора. Согласно установленным правилам, эта процедура может проводиться только после исключения мастоцитомы путем проведения тонкоигольной аспирации и цитологического исследования.
– Депигментация: гистобиоптаты получают с полностью депигментированных участков (минимум 2), с пограничной зоны между нормальной и лишенной пигмента кожи (1), а также один образец с нормальной кожи.
– Гиперпигментация: гистобиоптаты получают с пигментированных участков (минимум 2), а также один образец с нормальной кожи.
2) Интерпретация гистологического заключения
Обычно дерматогистопатолог выдаёт заключение, которое должно содержать следующие разделы:
1. Описание образца тканей
2. Морфологический диагноз
3. Этиологический диагноз (при возможности определения причины)
4. Комментарии
Гистологическое описание представляет собой информацию, которую видит патолог в препаратах. Гистологическое описание содержит ценную информацию с использованием множества терминов, что имеет огромное значение в диагностике. Однако требуется значительный опыт для объяснения этих увиденных изменений, поэтому клиницисту не всегда стоит доверять интерпретации заключения патолога. Знание базовой терминологии крайне необходимо для корректной интерпретации заключений лаборатории. К сожалению, большинство клиницистов вообще не читают описательную часть.
Морфологический диагноз представляет собой краткое изложение патологических изменений в гистологическом образце в одном предложении (что-то подобное: выраженная гиперплазия с образованием корок и периваскулярной эозинофильной инфильтрацией с чесоточными клещами в роговом слое). Морфологический диагноз основывается на терминах, использованных в описании гистопатологического образца.
Этиологический диагноз возможен, когда гистопатология специфична для какой-либо болезни. Например, в описанном выше случае, этиологический диагноз – «саркоптоз». Если этиологический диагноз установить не представляется возможным, патолог предлагает список дифференциальных диагнозов и, возможно, рекомендации по дальнейшей диагностике.
Клиницист никогда не должен вслепую полагаться на заключение, очень важно, чтобы врач связывал воедино клиническую картину и гистопатологическую информацию. Существует большое число болезней, диагноз которых может быть установлен гистологически, но многие из них можно подозревать по характерным признакам.
Наиболее частые гистопатологические заключения будут приведены ниже.
Эпидермальные нарушения
2. Гиперплазия – это неспецифический ответ эпидермиса на хроническое воспаление или травму, наблюдается при многих воспалительных процессах, сопровождающихся зудом.
3. Субкорнеальные и интраэпидермальные пустулы – как правило, встречаются при поверхностной пиодермии, а также при листовидной пузырчатке и некоторых редких стерильных пустулярных болезнях.
4. Субэпидермальные пустулы и везикулы – это очень редкий признак, встречается при наследственных и аутоиммунных болезнях, например, при обыкновенной пузырчатке.
5. Некрозы и язвы – обычно наблюдаются при ожогах, контактном дерматите, пиотравматическом дерматите («горячие пятна»), синдроме зуда в области головы и шеи у кошек, эозинофильном комплексе у кошек. Более редкими причинами является гепато-кожный синдром, мультиформная эритема/ токсический эпидермальный некролиз, некоторые лекарственные реакции, вирусные болезни кошек (вирус коровьей оспы, герпес-вирус), тимома у кошек. Язвы могут быть вторичными поражениями вследствие серьёзных болезней кожи, таких как васкулит.
Поражения дермы
1. Поверхностные поражения дермы – достаточно редки, могут наблюдаться при пиодермии кожно-слизистых зон, волчанке, мультиформной эритеме, эпителиотропной лимфоме, тимоме (у кошек), дерматомиозите.
3. Фолликулит/фурункулёз – в большинстве случаев указывает на поражение кожи инфекционной природы, вызванное, например, стафилококками, дерматофитами или демодексами. Другими причинами могут быть эозинофильный фурункулёз, листовидная пузырчатка, эпителиотропная лимфома.
5. Панникулит – этот признак можно наблюдать при глубоких подкожных бактериальных, микобактериальных и грибковых инфекциях, при стерильном нодулярном, идиопатическом панникулите, панстеатите, волчанке, также при местной реакции на инъекции, травмы. Может быть следствием панкреатита.
6. Васкулит - этот признак говорит о непосредственном повреждении кровеносных сосудов. Васкулит может присутствовать при весьма разнообразных процессах, таких как септический васкулит, иммуноопосредованные болезни, а также вследствие воздействия лекарств.
7. Атрофия – наблюдается при эндокринных болезнях, некоторых специфических алопециях, таких как сезонная алопеция боковой поверхности тела, паранеопластический синдром и ишемическая дерматопатия.
Подводя итог, можно сказать, что если у животных с признаками алопеции, шелушением и корочками, макулами, папулами, пустулами мне не удаётся установить диагноз путём проведения всех вышеперечисленных быстрых тестов, я прибегаю к проведению гистобиопсии. Нужно помнить, что в ряде случаев гистологическое исследование малоинформативно (например, у животных с хроническим зудом), поэтому хочу отметить крайнюю важность быстрых тестов у этих пациентов, а также необходимость клинической оценки и тщательного анализа анамнестических данных ветеринарным специалистом.
Литература
1. Cowell R.L., Tyler R.D., Meinkoth J.H., DeNicola D.B. Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat, 3rd ed., Mosby Elsevier, 2008.
2. Raskin R.E., Meyer D.J. Canine and Feline Cytology, Saunders Elsevier, 2nd ed., 2010.
3. Mc. Cullough S., Brinson J. Clinical Techniques in Small Animal Practice, Vol.14, No.4, November, 1999.
4. Taylor S.M. Small Animal Clinical Techniques, Saunders Elsevier, 2010.
Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.
Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.
Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.
Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.
Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.
Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.
Рис. 7. Игла и петли для посева. 1 - игла; бактериальные петли: 2, 3 - петли приготовлены неправильно; 4 - петля приготовлена правильно
Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и извлечении оттуда сохраняет водную пленку.
Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.
Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде . Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.
Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с двухкопеечную монету).
Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде . На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.
Приготовление мазка из гноя или мокроты . Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка.
Приготовление мазка из крови . Каплю крови наносят на предметное стекло на расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.
Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов трупов и пищевых продуктов твердой консистенции . Поверхность органа или пищевого продукта прижигают раскаленным скальпелем и из этого участка вырезают кусочек материала. Пинцетом осторожно захватывают этот кусочек и поверхностью среза прикасаются к предметному стеклу в двух - трех местах, делая ряд мазков-отпечатков.
Высушивание мазка
Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.
Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение структуры клеток.
Фиксация мазка
Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.
Способы фиксации. 1. Физический - в пламени горелки: стекло берут пинцетом или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки в течение 6 с.
2. Химический - в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и мазках-отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом- 5 мин; б) этиловым спиртом - 10 мин; в) смесью Никифорова - 10-15 мин; г) ацетоном - 5 мин; д) парами кислоты и формалина - несколько секунд.
Окраска препаратов
После фиксации приступают к окраске препарата.
Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.
Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.
Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).
Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.
Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь препарат.
Рецепты красителей
1. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):
Красителя - 1 г спирта 96% - 10 мл
Смесь помещают в термостат до полного растворения на несколько дней. Взбалтывают ежедневно. Хранят в склянках с притертыми пробками.
2. Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, спор и капсул):
Насыщенного спиртового раствора основного фуксина - 10 мл раствора карболовой кислоты 5% - 90 мл
Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот.
Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют и сливают во флакон для хранения.
3. Фуксин Пфейффера (для окраски по Граму и для простого метода окраски):
Фуксина Циля - 1 мл воды дистиллированной - 9 мл
Краситель готовят непосредственно перед применением.
4. Карболовый генциановый фиолетовый (для окраски по Граму):
насыщенного спиртового раствора
генцианового фиолетового - 10 мл
карболовой кислоты 5% - 100 мл
Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
5. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал):
Йодида калия - 2 г кристаллического йода - 1 г дистиллированной воды - 10 мл
Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды.
6. Щелочной раствор метиленового синего Леффлера:
Насыщенного спиртового раствора метиленового синего - 30 мл раствора гидроксида калия 1% - 1 мл дистиллированной воды - 100 мл
7. Бумажки по Синеву (для окраски по Граму):
1% спиртовой раствор кристаллического фиолетового
Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.
Методы окраски делят на ориентировочные (простые) и дифференциальные (сложные), выявляющие химические и структурные особенности бактериальной клетки.
Общие сведения
Если в ходе дерматологического обследования у врача возникает подозрение на то, что поражения кожи животного связано с развитием бактерий или грибов, то берутся анализы на цитологическое исследование.
Этот метод основан на взятии мазков-отпечатков с поверхности кожи, содержимого пустул и на стекло или отпечатков с поверхности кожи на клейкую ленту. С последующей окраской специальными красителями взятого материала. После окраски и высушивания мазков их исследуют под микроскопом.
Данный метод характеризуется быстротой выполнения (врач получает результат через 30-40 минут), относительной дешевизной.
В норме на поверхности кожи и в наружном слуховом канале могут обнаруживаться единичные количества бактерий и грибов. Однако их избыточный рост может привести к развитию воспаления. Поэтому необходимо оценить общее количество бактерий и грибов, наличие и количество разных клеток.
Данные цитологии кожи помогут врачу определиться с причинами дерматологического заболевания и назначить адекватное лечение, целью которого является восстановления нормальной микрофлоры кожи.
Материал
При подозрении на дерматологические заболевания перед посещением врача следует соблюдать все правила подготовки животного к посещению дерматолога: перед первичным обращением нельзя мыть животное, обрабатывать пораженные участки кожи, чистить или закапывать капли в уши за 3-4 дня.
Выбор материала для исследования зависит от результатов дерматологического осмотра животного.
В качестве материала для исследования могут быть взяты мазки-отпечатки на стекло или на клейкую ленту (проба со скотчем).
Мазки-отпечатки на клейкую ленту берут, когда поверхность сухая и не даёт мазка-отпечатка на стекле. При этом благодаря клейкой поверхности скотча необходимый материал берется в необходимом количестве. Отрезают необходимую длину скотча, прикладывают клейкой стороной к разным участкам кожи, слегка прижимая, и переносят ленту на чистое обезжиренное стекло.
Мазок-отпечаток на стекло берётся с влажных повреждений кожи. При этом чистое обезжиренное стекло прикладывают к коже и слегка прижимают.
При наличии пустул берут стерильным тампоном их содержимое и на чистом обезжиренном стекле делают тонкий мазок.
После взятия мазка-отпечатка его высушивают на воздухе, подписывают и отправляют в лабораторию.
Интерпретация результатов
При микроскопии окрашенных мазков отпечатков обнаруживают: бактерии (кокки, палочки), грибы, нейтрофилы, эозинофилы и другие клетки.
Бактерии. Кокки и палочки являются нормальной микрофлорой кожных покровов. Однако их избыточное количество может приводить к воспалительным процессам. Важным диагностическим признаком при описании бактерий является наличие фагоцитированных форм.
Грибы. Чаще в мазках-отпечатках обнаруживают дрожжеподобные грибы рода Malassezia. Они входят с состав нормальной микрофлоры кожных покровов, но при их усиленном размножении развивается воспаление.
Результат:
- «единичные», «+» - может быть нормой, но при наличии клинических симптомов может требовать лечения;
- «++», «+++», «++++» - обычно говорит об избыточном росте микроорганизмов или грибов и требует медикаментозного лечения.
Нейтрофилы – наиболее подвижные лейкоцитарные клетки. Наличие нейтрофилов в мазках-отпечатках часто связано с бактериальной или грибковой инфекциями.
В мазках могут присутствовать как дегенеративные, так и недегенеративные(неизмененные) нейтрофилы.
Наличие дегенеративных нейтрофилов предполагает наличие инфекции. Преобладание недегенеративных нейтрофилов указывает на асептическую среду и в этом случае микроорганизмы могут не обнаруживаться в мазке. И в этом случае можно предполагать наличие аутоиммунных процессов.
Если в мазках присутствуют макрофаги и нейтрофилы, то можно предполагать о наличие грибковой инфекции.
При микроскопии мазков-отпечатков обращают внимание и на наличие тканевых клеток. Обнаружение в мазке атипичных клеток, клеток, не свойственных области исследования, должно наводить на мысль о наличии новообразования. В этом случае рекомендуют обратиться к врачу-онкологу.
Лазарева Н.В.
Ветеринарный врач-лаборант
лаборатории «BIOVETLAB»
