Слайд 2
Биотехнология
Клони́рование (англ. cloning от др.- греч. κλών - «веточка, побег, отпрыск») - в самом общем значении - точное воспроизведение какого-либо объекта N раз. Объекты, полученные в результате клонирования, называются клоном. Причём как каждый по отдельности, так и весь ряд.
Слайд 3
Технология клонирования
Технология клонирования состоит в том, что из яйцеклетки при помощи микрохирургической операции удаляется ядро и вместо него вводится ядро соматической клетки другой особи (донора), в которой содержатся гены только донорского организма. Различия в геномах родительского организма и его клона составляют от 0,05% до 0,1%. Второй вариант технологии – это энуклуация соматической клетки и введение в нее ядра яйцеклетки. В связи с тем, что различия, хоть и минимальные существуют, в строгом смысле слова клон не является абсолютно идентичным родительскому организму.
Слайд 4
Естественное клонирование (в природе) у сложных организмов
У растений естественное клонирование происходит при различных способах вегетативного размножения. Клонирование широко распространено в природе у различных организмов.
Слайд 5
Клонирование животных
У животных клонирование происходит при амейотическом партеногенезе и различных формах полиэмбрионии. Так, среди позвоночных известны клонально размножающиеся виды ящериц, состоящие из одних партеногенетических самок. Уникальный вариант естественного клонирования открыт недавно у муравьёв - малого огненно муравья (Wasmanniaauropunctata) самцы и самки которого клонируются независимо, так что генофонды двух полов не смешиваются. В некоторых яйцах, оплодотворенных самцами, все хромосомы матери разрушаются, и из таких гаплоидных яиц развиваются самцы.
Слайд 6
У человека естественные клоны - монозиготные близнецы.
Слайд 7
Молекулярное клонирование
Молекулярное клонирование - клонирование молекул, другими словами - наработка большого количества идентичных ДНК-молекул с использованием живых организмов. Это технология клонирования наименьших биологических объектов - молекул ДНК, их частей и даже отдельных генов. Для молекулярного клонирования ДНК вводят в вектор (например, бактериальную плазмиду или геном бактериофага). Размножаясь, бактерии и фаги многократно увеличивают и количество введенной ДНК, в точности сохраняя её структуру. Такое клонирование необходимо для изучения биологических молекул, их идентификации, решения вопросов клонирования тканей и др.
Слайд 8
Клонирование многоклеточных организмов
Наибольшее внимание учёных и общественности привлекает клонирование многоклеточных организмов, которое стало возможным благодаря успехам генной инженерии. Различают полное (репродуктивное) и частичное клонирование организмов. При полном воссоздаётся весь организм целиком, при частичном - организм воссоздаётся не полностью (например, лишь те или иные его ткани).
Слайд 9
В 1997 году клонирование реконструировалось, когда Ян Вилмут и его коллеги в Рослинском Институте в Эдинбурге, Шотландии, успешно клонировали овцу по имени Долли. Долли была первое клонированное млекопитающее. Вилмут и его коллеги пересаживали ядро из клетки грудной железы овцы Финна Дорсетта в определенную яйцеклетку Шотландской черномордой овцы. Комбинация яйцеклетки-ядра стимулировалась электричеством, чтобы соединить и то и другое и стимулировать деление клетки. Новая клетка разделилась и была помещена в матку черномордой овцы, чтобы развиться. Долли была рождена на несколько месяцев позже. Долли с тех пор выросла и произвела на свет несколько особей обычным половым методом. Это говорит о том, что клон Долли абсолютно здоров.
Слайд 10
Клонирование человека
Клони́рованиечелове́ка - действие, заключающееся в формировании и выращивании принципиально новыхчеловеческих существ, точно воспроизводящих не только внешне, но и на генетическом уровне того или иногоиндивида, ныне существующего или ранее существовавшего. ЗА ПРОТИВ
Слайд 11
Репродуктивное клонирование человека
Репродуктивное клони́рование человека - предполагает, что индивид, родившийся в результате клонирования, получает имя, гражданские права, образование,воспитание, словом - ведёт такую же жизнь, как и все «обычные» люди. Репродуктивное клонирование встречается со множеством этических, религиозных, юридическихпроблем, которые сегодня ещё не имеют очевидного решения. В некоторых государствах работы по репродуктивному клонированию запрещены на законодательном уровне.
Слайд 12
Терапевтическое клонирование человека
Терапевти́ческоеклони́рованиечелове́ка - предполагает, что развитие эмбриона останавливается в течение 14 дней, а сам эмбрион используется как продукт для получения стволовых клеток. Законодатели многих странопасаются, что легализация терапевтического клонирования приведёт к его переходу в репродуктивное. Однако в некоторых странах (США, Великобритания) терапевтическое клонирование разрешено.
Слайд 13
Препятствия клонированию
Технологические трудности и ограничения Самым принципиальным ограничением является невозможность повторения сознания, а это значит, что речь не может идти о полной идентичности личностей, как это показывается в некоторых кинофильмах, но только об условной идентичности, мера и граница которой ещё подлежит исследованию, но для опоры за базис берётся идентичность однояйцевых близнецов. Невозможность достичь стопроцентной чистоты опыта обуславливает некоторую неидентичность клонов, по этой причине снижается практическая ценность клонирования.
Слайд 14
Социально-этический аспект
Опасения вызывают такие моменты, как большой процент неудач при клонировании и связанные с этим возможности появления неполноценных людей. А также вопросы отцовства, материнства, наследования, брака и многие другие.
Слайд 15
Этико-религиозный аспект
С точки зрения основных мировых религий клонирование человека является или проблематичным актом или актом, выходящим за рамки вероучения и требующим у богословов чёткого обоснования той или иной позиции религиозных иерархов.
Слайд 16
Главная причина клонирования растений и животных в том, чтобы произвести организмы с определенными качествами, которые необходимы человеку, такие как награжденная орхидея или генетическая инженерия, например овца была выведена чтобы предоставить человеческий инсулин. Если бы ученые полагались только на половое (сексуальное) размножение чтобы вывести этих животных, они бы рисковали тем, что необходимые им качества исчезли, так как половое размножение (сексуальное) переставляет генетический код в блоках. Другими причинами для клонирования могут быть потерянные или умершие домашние животные или животные, которые находятся на грани вымирания. Какими бы не были причины, новые технологии клонирования разожгли много этических спорах среди ученых. Некоторые государства рассмотрели или предписали законодательство, чтобы замедлить, ограничить или запретить эксперименты клонирования. Ясно, что клонирование будет частью нашей жизни в будущем, но будущее этой технологии должно всё же быть определено.
Посмотреть все слайды
Особый интерес в биоэтическом контексте представляет проблема клонирования. Выделяют несколько методов клонирования :
Манипуляции со стволовыми клетками;
Пересадка клеточного ядра.
Уникальность стволовых клеток заключается в том, что, когда они попадают на поврежденные участки разных органов, то они способны превращаться в клетки именно такого типа, которые необходимы для восстановления ткани (мышечные, костные, нервные, печеночные и т.д.). То есть, используя технологию клонирования, можно «на заказ» выращивать необходимые человеческие органы. Настоящая фантастика, однако, где взять стволовые клетки? Результаты многолетних экспериментов таковы:
Абортивный материал при естественном и искусственном оплодотворении;
Извлечение стволовых клеток из уголков и борозд мозга, костного мозга и волосяных фолликул взрослого организма и других тканях;
Кровь из пупочного канатика;
Откачанный жир;
Выпавшие детские зубы;
Изучение стволовых клеток взрослого организма, безусловно, обнадеживают и не вызывают этических проблем в отличие от эмбриональных стволовых клеток. Общепризнано, что лучшим источником стволовых клеток для терапевтического клонирования (т.е. получения эмбриональных стволовых клеток) являются эмбрионы. Однако в связи с этим нельзя закрывать глаза на потенциальные опасности. Европейская группа по этике выдвинула на первый план проблему прав женщин, которые могут попасть под сильное давление. Кроме того, специалисты отмечают проблему добровольного и информированного согласия для донора (а также анонимности) и для получателя клеток. Дискуссионным остаются вопросы о приемлемом риске, о применении этических стандартов в исследованиях на людях, охрана и безопасность клеточных банков, конфиденциальность и защита частного характера генетической информации, проблема коммерциализации, защита информации и генетического материала при перемещении через границу и т.д.
В большинстве стран мира существует полное или временное запрещение на репродуктивное клонирование человека. Во Всеобщей Декларации о геноме человека и правах человека ЮНЕСКО (1997 г.) запрещена практика клонирования с целью воспроизводства человеческой особи.
Другим методом клонирования является пересадка клеточного ядра. Сегодня таким образом получено много клонов различных видов животных: лошади, кошки, мыши, овцы, козы, свиньи, быки и т.д. Ученые констатируют, что клонированные мыши живут меньше и больше подвержены разным заболеваниям. Исследования по клонированию живых существ продолжаются.
Темы рефератов и докладов:
1. Медико-генетическая информация: моральные проблемы получения и использования.
2. Моральные проблемы генной терапии.
3. Экспертиза биобезопасности генетически модифицированных организмов.
4. Регистрация и регламентация генетически модифицированных продуктов: теория и практика.
5. Этические проблемы международного проекта «Геном человека».
6. Клонирование человека: уроки дискуссии.
7. Национальная система биобезопасности Республики Беларусь.
Вопросы для самоконтроля:
1. Что такое биотехнология, биобезопасность, генная инженерия.
2. Что такое «трансгенный организм»? Какова цель создания трансгенных организмов?
Древние были уверены в существовании вечно возраждающейся из пепла птицы Феникс. Древнеегипетский бог Гор раз за разом собирал разбросанные по всем сторонам света куски тела своего отца Озириса и оживлял его с помощью матери Исиды. Не удивительно, что ученые называли гидрой кишечнополостное наших водоемов – ее способность к регенерации просто сказочна. Регенерация тканей наблюдается и у человека: срастание костей, заживление кожи и мышц, постоянно протекающий в нашем организме процесс «творения» крови.
Загадка кроветворения не давала покоя нашему выдающемуся ученому Александру Александровичу Максимову, который еще в 1916 г. начал использовать метод культуры ткани. Напомним, что за разработку данного метода француз А.Каррель, долго работавший за океаном, был удостоен в 1912 г. Нобелевской премии. В 1922 г. Максимов уехал из России и оказался в конечном итоге в Чикаго, где занимался исследованиями в области воспаления и кроветворения.
В 1908 г. Нобелевской премии за исследования процесса воспаления и открытие макрофагов был удостоен И.И. Мечников. Ученых начала века волновал вопрос: откуда при воспалении берутся многочисленные клетки соединительной ткани, в результате чего образуются припухлость, флюс и нарыв?
Максимов постулировал, что в соединительной ткани (крови, костном мозге, являющемся органом кроветворения) пожизненно сохраняются недифференцированные, так называемые мезенхимные, или камбиальные, клетки, которые могут превращаться в различные клетки крови, а также кости, сухожилия, связки и т.д. Он называл их еще «блуждающими клетками в покое». Наличием этих клеток он и объяснял образование новых клеток при воспалении.
Поясним некоторые слова. Дифференцировкой называется «специализация» клетки, в ходе которой та приобретает свойства, необходимые для выполнения возложенной на нее природой функции. Недифференцированная клетка не способна сокращаться, как мышечная, генерировать электрический сигнал, как нервная, и синтезировать гормон инсулин, как клетки островков Лангерганса поджелудочной железы. Говорят еще, что в процессе дифференцировки клетки созревают.
Обычно в названии незрелых клеток имеется слово «бласт», то есть «шар» (бластула – это шарообразная стадия развития эмбриона, при этом стенка шара представлена одним слоем клеток). Клетка – предшественник кости называется остеобластом; предшественник меланоцита, синтезирующего темный красящий пигмент меланин, благодаря которому мы темнеем при загаре, – меланобластом, а клетки нервной системы – нейробластами. Эти «первичные» клетки действительно похожи на шарики: нейро- и меланобласт не имеют характерных для взрослых стадий отростков, которые появляются только в ходе дифференцировки.
Нечто похожее видел в культурах и Максимов. Так «общим родоначальником кроветворения» он считал большой лимфоцит, который происходит от первичной мезенхимной клетки через стадию малого лимфоцита, представляющего относительно небольшую клетку с большим ядром.
Слово «мезенхима» греческого происхождения и означае «посредник». Максимов вслед за эмбриологами XIX в. считал, что мезенхима представляет собой средний (между экто- и эндодермой) зародышевый листок, из которого образуется затем соединительная ткань и ее производные в виде сосудов, крови, хряща и кости. Сегодня мы знаем, что мезенхимные клетки выселяются из верхней спинной (дорзальной) половины нервной трубки, так что тоже имеют эктодермальное происхождение. Вот почему у нейрона и лимфоцита так много сходных генов и свойств.
Интерес к клеткам-предшественникам (прекурсорам) возродился в 1960-е гг., когда Дж.Гердон, эмбриолог из Оксфордского университета, поразил весь мир клонированными лягушками. Гердон придумал метод переноса ядра одной клетки в цитоплазму другой.
Для своих опытов он взял икринки, видимые невооруженным глазом, и удалил из них ядра. Таким образом, он получил «энуклеированную» цитоплазму, в которую и пересадил диплоидные ядра (с двойным набором хромосом) соматических клеток, которые и в обычных условиях постоянно делятся (клетки слизистой кишечного эпителия). Таким образом для своих экспериментов по клонированию Гердон, возможно, использовал стволовые клетки кишечного эпителия. Но тогда так никто проблему не рассматривал.
Практически одновременно с работами Гердона стали появляться статьи, посвященные описанию нейрогенеза в гиппокампе мозга. Сначала образование новых нервных клеток видели просто под микроскопом, затем наблюдения стали подтверждать с помощью авторадиографии, которая свидетельствовала о синтезе новых молекул ДНК. В конечном итоге процесс был подтвержден и с помощью электронного микроскопа. Но народ и поныне убежден, что «нервные клетки не восстанавливаются».
Гердон задавался вопросом, каким образом цитоплазма яйцеклетки перепрограммирует соматическое ядро, т.е. ядро дифференцированной клетки. Созревает клетка не сразу. Для этого она должна пройти несколько клеточных циклов.
Стволовая клетка в процесс созревания не вступает. Ранее полагали, что она при этом и не делится, находясь в состоянии «ареста» клеточного цикла, т.е. как бы в «замороженном» состоянии. Однако сейчас выясняется, что все намного сложнее, по крайней мере в клеточных культурах. Но об этом ниже.
В самое последнее время экспериментаторы, возможно, под влиянием экологов, выдвинули концепцию ниши. Ниша – это клеточное окружение, в котором клетка не только живет, но и выходит из состояния ареста, чтобы начать развитие.
Классическим примером ниши является граафов пузырек яичника, в котором яйцеклетка может пребывать в состоянии клеточного ареста в течение всей жизни женской особи. Кстати заметим, что яйцеклетка до самого момента оплодотворения содержит – в отличие от спермия – двойной набор хромосом (второй набор удаляется только после внедрения спермия). Таким образом, чисто теоретически яйцеклетка до образования зиготы по набору хромосом ничем не отличается от любой другой соматической клетки.
Еще одной нишей является дно волосяного фолликула, где «обитают» стволовые клетки, из которых образуются меланоциты. Нишей же нейрогенеза, помимо гиппокампа, является также субвентрикулярная зона. Это слой клеток, окружающих мозговые желудочки – полости в глубине полушарий, заполненные жидкостью, похожей на лимфу. Именно в этой зоне постоянно образуются новые нервные клетки, которые затем мигрируют в направлении носа. Это открытие было сделано в начале 1990-х гг. и доказано экспериментально!
Обонятельные нейроны постоянно контактируют с разного рода летучими веществами атмосферы. Это для нас они означают ароматы и запахи, а для обонятельных нейронов они токсичны, особенно в больших концентрациях. Вот и приходится постоянно генерировать новые нервные клетки, чтобы восполнить их дефицит.
Но дело не только в химикатах. Обонятельные нейроны располагаются ближе к поверхности слизистой носа, чем все другие нервные клетки. От внешней среды их отделяют какие-то несколько микронов слизи, выделяемой слизистым эпителием. И гораздо большую опасность для обонятельных нейронов представляют постоянные вирусные атаки, особенно во время эпидемий респираторных заболеваний. Вот почему слизистая носоглотки представляет собой третью нишу постоянного нейрогенеза.
В первом номере журнала Science за 1995 г. была опубликована статья о выделении и определении свойств гематопоэтических стволовых клеток человека. Частота встречаемости стволовых клеток составляет около 1 на 105 клеток костного мозга. Незадолго до того, в середине ноября 1994 г., журнал Nature напечатал статью об изоляции из эмбрионального мозга крыс самообновляющихся мультипотентных стволовых клеток мозговой коры. Так занималась заря экспериментального изучения стволовых клеток в их естественных нишах и изолированных культурах.
Параллельно этому разворачивались исследования процессов перепрограммирования. Выше уже говорилось о перепрограммировании самой яйцеклетки и ядра соматической клетки, помещенного в ее цитоплазму. Сегодня мы знаем, что перепрограммирование может быть осуществлено путем добавления ядерного и цитоплазматического экстракта яйцеклеток, а также «первичных» Т-лимфоцитов человека.
Перепрограммированию способствует также добавление ростовых факторов – специальных белков, которые стимулируют рост и размножение клеток. О действии ростовых факторов ученые знают довольно давно, поэтому в культуры клеток обычно добавляют сыворотку телячьей крови, которая их содержит. Можно действовать более целенаправленно, например, культивировать клетки с «представителями» других тканей. Это приводит к смене клетками типа ткани. Так, если взять фибробласты кожи и добавить в культуральную среду экстракт предшественников (прекурсоров) нейрональных клеток, то фибробласты начинают синтезировать нехарактерный для них белок нервных волокон. Дело доходит даже до того, что у фибробластов появляются нервные отростки – дендриты.
Но все эти воздействия были ненаправленными. Преимуществом современного подхода является четко направленное воздействие, которое включает нужные гены, позволяя тем самым управлять развитием клеток. Уже относительно давно в ходе онкологических исследований был выделен так называемый ФИЛ – фактор подавления лейкемии. Этот белок, который является транскрипционным (активирующим транскрипцию) фактором, подавляет развитие мезодермальных, в частности мышечных, клеток и стимулирует начало нейрональной дифференцировки. Можно сказать, что он перепрограммирует стволовые клетки на путь развития нервных клеток.
ФИЛ, можно надеяться, позволит решить одну важную проблему клонирования. Дело в том, что эмбриональные стволовые клетки при всей своей плюрипотентности обладают одним неприятным свойством – они образуют тератомы, т. е. уродливые разрастания. В этом отношении гораздо лучше использовать стволовые клетки взрослого организма, тем более что ученые уже научились «расширять» пределы тканевой специфичности, т. е. получать потомство клеток одних тканей с характеристиками других тканей.
Но у взрослых свои проблемы, одной из которых является небольшой пролиферативный потенциал (клетки довольно быстро перестают делиться). Так вот добавление ФИЛа приводит к снятию этого ограничения: мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из костного мозга взрослой мыши, претерпевали в культуре более 80 делений! По внешнему виду клетки точь-в-точь максимовские: диаметром 8–10 мкм, округлые, с большим сферическим ядром и тонким ободком цитоплазмы. Способность к делению подтверждается и сохранностью теломер. Напомним, что это концевые участки хромосом, которые имеют одноцепочную ДНК. При каждом делении 200–300 нуклеотидов этой ДНК «отрезаются», в результате чего длина теломер сокращается. По достижении определенного предела клетка теряет способность делиться и подвергается апоптозу.
Стволовые клетки после переноса их облученному животному восстанавливают гемопоэз, печеночный эпителий, а также клетки легких и кишечника. У них нет характерных для взрослых клеток иммунологических мембранных белков, запускающих в норме реакцию отторжения. Кроме того, в них высока активность теломеразы – фермента, который синтезирует теломерную ДНК. Средняя длина теломер составляет у клеток культуры 27 килобаз, т. е. тысяч «букв» ген-кода. Такая величина «устанавливается» после 40 клеточных делений и остается неизменной и после 102!
Для направления развития клеток костного мозга по пути нейронов ученые ввели в культуру так называемый «Нурр» – «нуклеарный (ядерный) рецептор», – представляющий собой транскрипционный фактор, специфичный для предшественников среднего мозга, «направляющимся» по пути развития допаминовых нейронов (гибель которых приводит к развитию паркинсонизма). Полученные таким образом допаминовые нейроны имеют те же электрофизиологические характеристики, что и нормальные. После пересадки таких нейронов крысе с моделью паркинсонизма у нее восстанавливаются нормальные движения лап.
В других экспериментах было показано, что процесс перепрограммирования состоит как минимум из пяти стадий. На первом этапе с помощью цитомегаловируса (естественно модифицированного, чтобы он не мог размножаться в клетках) был перенесен ген Нурр, в результате чего был простимулирован ген тирозин-гидроксилазы. Этот фермент добавляет группу –ОН к аминокислоте тирозину, в результате чего начинает вырабатываться допамин. Помимо этого Нурр «открыл» и ген тубулина – белка, из которого делаются тубулы, микротрубочки, без которых нельзя себе представить нервную клетку: по микротрубочкам, как известно, идет транспорт нейротрансмиттеров, например того же допамина, к синапсам, где они и выделяются.
На ранних этапах эмбриональные стволовые клетки могут превращаться и в инсулинсинтезирующие клетки. Тем самым открывается путь помощи миллионам диабетиков, которые так нуждаются в этом белковом гормоне (только в США этот диагноз ставят ежегодно 800 пациентов).
Можно на одной из стадий направить развитие стволовых клеток и по пути серотониновых нейронов. Серотонин также является одним из важнейших нейротрансмиттеров, недостаток его ведет к различным психическим расстройствам, начинающимся с депрессии. Интересно, что развитие нейронов зависит от действия ростового фактора фибробластов, т. е. клеток соединительной (мезодермальной) ткани. Этим лишний раз подтверждается факт «единства» происхождения нейро- и мезодермы. Добавление фактора роста фибробластов вызывает увеличение количества серотониновых нейронов в 2,5 раза. При этом уменьшается количество клеток с тирозингидроксилазой, т. е. допаминовых.
Если в клетки внести побольше копий гена Нурр, то доля допаминовых нейронов культуры возрастает с 5 до 50%. Если же на 4-й стадии добавить еще пару стимуляторов развития именно допаминовой «ветви», то число таких клеток возрастает почти до 80%.
Сейчас задача – постараться как можно быстрее перенести опыты с мышей на человека. Во многом эта проблема связана с самой техникой культивирования стволовых клеток: их «высаживают» на фидерные (питающие) мышиные клетки и добавляют плазму крови телят (сыворотку). Это потенциально опасно тем, что клетки человека можно заразить ретровирусами животных. Такие клетки не могут использоваться для лечения человека. Это позволяет проверить все продукты с помощью стандартных тестов на СПИД, герпес, гепатит и т.д.
Однако недавно запатентован метод, в котором в качестве фидерных клеток используются мышечные клетки человека, а для стимуляции роста добавляется сыворотка крови человека.
Пока же опыты в основном идут на животных. Для решения многих практических и теоретических проблем необходимо получение как можно более «чистого» в генетическом отношении материала.
1 – удаление ядра из яйцеклетки; 2 – «внесение» диплоидного ядра лимфоцита; 3 – стадия бластоциста с эмбриональными стволовыми клетками; 4 – культура стволовых клеток и эмбрион из них; 5 – суррогатная мать и мышонок; 6 – взятие лимфоцита у обычной мыши
Тут следует сделать одно теоретическое отступление. Дело в том, что в лимфоцитах постоянно происходят так называемые генные реаранжировки, или перестройки, «тасование» генных участков, отвечающих за синтез антител. Благодаря этому «тасованию» иммунные клетки получают возможность отвечать на разнообразие белков постоянно меняющихся болезнетворных агентов. В норме в обычных тканях вне иммунной системы такие аранжировки не происходят. Это позволяет хотя бы частично решить проблему перепрограммирования, которое во многом зависит от цитоплазмы яйцеклетки. Лимфоциты хорошо подходят для решения этой проблемы, поскольку все их потомство есть клон, сохраняющий одни и те же генные маркеры.
Были получены две линии мышей: одна из В-клетки, а вторая была потомком Т-лимфоцита. Надо отметить, что лимфоциты довольно плохо поддаются перепрограммированию. В-лимфоцитарные мыши имели реаранжировки гена иммуноглобулина во всех тканях и были жизнеспособны. А вот потомство Т-лимфоцита оказалось с жизнью «несовместимым» – эмбрионы гибли внутриутробно, а единственный родившийся оказался мертвым. Таким образом, попытка получить моноклональное потомство показало разный потенциал со стороны клеток, их способность или неспособность перепрограммироваться, а также наличие других проблем. Так что придется все же вернуться к стволовым клеткам костного мозга, о которых писал Максимов, хотя потенциал их и довольно ограничен, если речь идет об организме, а не о культуре, где можно вводить разные гены на разных стадиях дифференцировки.
В одном из экспериментов облученным мышам одной линии (с убитым костным мозгом) перенесли 2 тыс. костномозговых клеток другой линии. Последние несли генетический маркер, благодаря которому при действии одного из веществ окрашивались в синий цвет. Через 12 недель окрашивалось от 80 до 95% кровяных клеток реципиента. Через 4 месяца мышек забили. На срезах головного мозга нервных клеток, окрашивающихся в синий цвет, ученым увидеть так и не удалось. А те, что окрасились (менее 5 клеток), имели округлую форму и не несли никаких отростков. Таким образом, превращения клеток костного мозга в клетки головного мозга в организме не происходит.
Поскольку стволовые клетки сохраняются в организме в течение всей жизни, мы должны были бы жить дольше и при этом не болеть, так как стволовые клетки должны заменять умершие и заболевшие в наших органах. Однако этого, как все знают, нет.
Сейчас во многом внимание ученых сконцентрировано на теломерах, как главных регуляторах клеточного деления, без которого не бывает дифференцировки. При дефектах в теломерах вернее находящихся с ними в комплексе белков, возникает состояние ускоренного укорачивания их длины. Один из белков получил название Est, что является сокращенным английским выражением «постоянно укорачивающиеся теломеры» (Evershortening telomeres ). Такое состояние быстро приводит к преждевременной смерти клеток.
Est стимулирует теломеразу, которая удлиняет ДНК теломер, задерживая тем самым достижение предела жизни клетки. Казалось бы, к чему все эти детали, если ученые уже научились управлять дифференцировкой стволовых клеток в культуре? Тут можно возразить.
Во-первых, стволовые клетки разных линий мышей по-разному сопротивляются повреждению ДНК, например ультрафиолетом. Скрещивание разных линий выявило в 11-й хромосоме локус «ремонта ДНК», который ответствен за «починку» молекулы жизни, если в ней образуются одно- и двуцепочные разрывы после облучения или действия свободных радикалов кислорода. Такой же локус есть и в 11-й хромосоме человека. Вполне возможно, что все это имеет отношение к теломерам, поскольку там тоже есть дву- и одноцепочная ДНК...
С точки зрения дифференцировки, как эмбриональные, так и взрослые стволовые клетки представляют собой поезд, который уже ушел. Гораздо проще было бы разобраться во многих вопросах клеточной биологии, если бы могли анализировать процессы с самого начала, а именно с гамет. Но культуры гамет до сих пор не было...
И вот два самых свежих сообщения. Прежде всего, удалось наладить дифференцировку в культуре сперматогониев – стволовых клеток семенников, из которых образуются спермии. Достигнуто это с помощью переноса в сперматогонии каталитической единицы теломеразы (это вторая причина, почему ученые так интересуются теломерами).
Сперматогонии выделяли у 6-дневного мышонка, после чего в них с помощью ретровируса вносился ген теломеразы. При этом были получены стволовые клетки – с большим округлым ядром и небольшим ободком цитоплазмы (опять Максимов!). И через год культивирования эти стволовые клетки имели «свежую» морфологию.
В них появляется РНК-связывающий белок, который характерен для стволовых клеток, а также транскрипционный фактор Oct, который необходим для развития плюрипотентных эмбриональных клеток. Известно, что у самцов Oct сохраняется до начала дифференцировки сперматогониев и начала сперматогенеза.
Похоже, что многие неудачи ученых, с которыми им приходилось сталкиваться до сих пор, связаны с... выделением яйцеклетки из фолликула! Дело в том, что она окружена тремя слоями питающих и защитных клеток, которые, в частности, накладывают на нее «арест», о котором говорилось выше. Ученые Коннектикутского университета решили выделить весь фолликул, после чего «зажали» его между двумя покровными стеклами. Размер фолликула 260–470 мкм, поэтому с ним удобнее и легче работать, нежели с «голой» яйцеклеткой.
Для того чтобы понять, что является причиной ареста, ученые ввели микропипеткой под мембрану ооцита моноклональные антитела против так называемой стимулирующей субъединицы Г-белка. Г-белки – это ферменты, добывающие энергию при расщеплении не АТФ, а гуанозинтрифосфата (ГТФ). Тратят эту энергию они на разные вещи, в том числе и на стимуляции мембранного фермента аденилатциклазы, которая из ATФ «делает» циклический аденозинмонофосфат (цАМФ).
Мембрана клетки с различными рецепторами, ионными каналами (Ca2+, Na+) и ферментами
Циклический AMФ является важнейшим регулятором процессов в цитоплазме, вызывая в том числе и арест жизненного цикла яйцеклетки. Введение моноклональных антител против Г-белка приводит к блоку аденилатциклазы и падению уровня цАМФ, в результате чего арест преодолевается, и клетка вступает в мейоз. Тем самым смоделировано действие лютеинизирующего гормона гипофиза, который то же самое делает каждый месяц с той или иной яйцеклеткой в яичниках. Так что вполне возможно, что скоро мы услышим и о культуре ооцитов, с помощью которой исследователям удастся разобраться в тех процессах, которые происходят на самых первых этапах развития (еще до оплодотворения).
И последнее. Удалось, по всей видимости, понять и причину других неудач, связанных с клонированном. Дело в том, что для начала клонирования и получения стволовых клеток необходимо «изъять» ядро ооцита из цитоплазмы и на его место ввести ядро диплоидной соматической клетки. При этом через разрыв мембраны яйцеклетки вытекает до трети цитоплазмы с ее питательными и регуляторными веществами и протеинами. Из-за этого клоны и оказываются нежизнеспособными.
Уже относительно давно было предложено «делить» цитоплазму ооцита на две половинки – содержащую ядро и без него. Последняя получила название «цитопласт». Теперь Габор Байта из Сельскохозяйственного института в Копенгагене предложил вообще не изымать ядро соматической клетки, а просто «сливать» ее с одним или двумя цитопластами. При этом не нужны дорогостоящие манипуляторы и высококвалифицированные специалисты – все может делаться буквально в полевых условиях студентами или лаборантами.
Метод уже опробовали австралийские ученые, которые с его помощью резко повысили «выход» клонированных телят: из 7 бластоцистов – «шариков» из эмбриональных клеток, – перенесенных в матки коров, шесть имплантировались в слизистой и привели к беременности, в результате которой родились бычки и телки. Напомним, что овечка Долли родилась в результате более чем 300 неудачных попыток.
По материалам журналов Nature и Science .
Эдди Лоренс, для BBCRussian.com
В последнее время в политических, научных кругах и в средствах массовой информации ведутся активные дебаты о двух разновидностях клонирования: терапевтическом и репродуктивном, - а также о так называемых "стволовых клетках" и их значении для дальнейшего развития современной медицины.
Что все это значит с точки зрения специалиста?
Репродуктивное клонирование
Это искусственное воспроизведение в лабораторных условиях генетически точной копии любого живого существа. Овечка Долли, появившаяся на свет в эдинбургском институте Рослин, - пример первого такого клонирования крупного животного.
Процесс делится на несколько стадий. Сначала у женской особи берется яйцеклетка, из нее микроскопической пипеткой вытягивается ядро. Затем в безъядерную яйцеклетку вводится любая клетка, содержащая ДНК клонируемого организма. Фактически, она имитирует роль сперматозоида при оплодотворении яйцеклетки. С момента слияния клетки с яйцеклеткой начинается процесс размножения клеток и рост эмбриона (схема 1).
Во многих странах мира, включая Великобританию, репродуктивное клонирование человека с целью получения детей-клонов запрещено законом.
Терапевтическое клонирование
Это то же репродуктивное клонирование, но с ограниченным до 14 дней сроком роста эмбриона или, как говорят специалисты, "бластоциста". По прошествии двух недель процесс размножения клеток прерывается.По мнению большинства ученых, после 14-дневного срока в эмбриональных клетках начинает развиваться центральная нервная система и конгломерат клеток (эмбрион, бластоцист) уже следует считать живым существом.
Терапевтическим такое клонирование названо только потому, что образующиеся в течение первых 14 дней эмбриональные клетки способны в дальнейшем превращаться в специфические тканевые клетки отдельных органов: сердца, почек, печени, поджелудочной железы и т.д. - и использоваться в медицине для терапии многих заболеваний.
Такие клетки будущих органов названы "эмбриональными стволовыми клетками".
В Великобритании ученым разрешается применять терапевтическое клонирование и проводить исследования на стволовых клетках в медицинских целях.
В России многие ученые (например, академик РАМН Н.П.Бочков, профессор В.З.Тарантул из Института молекулярной генетики) не любят употреблять выражение "терапевтическое клонирование" и предпочитают называть этот процесс "клеточным размножением".
Эмбриональные стволовые клетки
Они образуются в эмбрионе (бластоцисте) в первые дни размножения. Это родоначальники клеток почти всех тканей и органов взрослого человека.Они были известны эмбриологам давно, но в прошлом из-за отсутствия биотехнологии их лабораторного выращивания и сохранения такие клетки уничтожались (например, в абортариях).
За последние десятилетия была разработана не только биотехнология искусственного получения эмбриональных стволовых клеток путем клонирования, но и созданы специальные питательные среды для выращивания из них живых тканей.
Будущая медицина - медицина "запасных частей"
Развитие многих направлений медицины ближайшего столетия будет базироваться на использовании эмбриональных стволовых клеток.
Поэтому уже сегодня в научных и политических кругах так много внимания уделяется вопросам терапевтического клонирования и исследованиям стволовых клеток в медицинских целях.
Какова практическая польза?
Разработка биотехнологии получения в большом количестве стволовых клеток даст возможность медикам лечить многие до сих пор неизлечимые заболевания. В первую очередь - диабет (инсулинзависимый), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера (старческое слабоумие), болезни сердечной мышцы (инфаркты миокарда), болезни почек, печени, заболевания костей, крови и другие.
Новая медицина будет базироваться на двух основных процессах: на выращивании здоровой ткани из стволовых клеток и пересадке такой ткани на место поврежденной или больной.В основе же метода создания здоровых тканей лежат два сложных биологических процесса: первоначальное клонирование человеческих эмбрионов до стадии появления "стволовых" клеток и последующее культивирование таких клеток и выращивание на питательных средах необходимых тканей и, может быть, органов.
Профессор Вячеслав Тарантул из московского Института молекулярной генетики РАН даже предлагает с момента рождения любого ребенка создавать из эмбриональных клеток (например - его же пуповины) банк стволовых клеток каждого ребенка. Через 40-50 лет при заболевании или повреждении каких-либо органов и тканей из этого банка всегда можно будет вырастить замену поврежденной ткани, причем генетически полностью идентичную этому человеку. Никаких чужеродных донорских органов и трансплантаций в таком случае не нужно (схема 2).
В чем опасность?
Если процесс размножения клеток, полученных в результате клонирования (в том числе в терапевтических целях), не останавливается на предельном 14-дневном сроке, и эмбрион помещается в матку женщины, то такой эмбрион превратится в плод и в дальнейшем в ребенка. Таким образом, в определенных условиях "терапевтическое" клонирование может превратиться в "репродуктивное".
Некоторые специалисты уже сейчас пытаются использовать биотехнологию клонирования, например, для лечения бесплодия бездетных семей путем создания детей-клонов бесплодных родителей (итальянский профессор Северино Антинори, американский профессор Панос Завос и другие).
В Великобритании репродуктивное клонирование детей карается тюремным заключением сроком до 10 лет.
Сразу две генетических новости пришло из незалежной Японии.
Первая, интересная с точки зрения будущего человека, заключается в удачном опыте получения функционирующих тканей головного мозга из стволовых клеток. Изначально, целью эксперимента было воссоздание тканей коры головного мозга (который, как завещал И.П.Павлов: «Высший распорядитель и распределитель функции организма животного и человека»), но в итоге исследователям удалось получить клетки различных тканей. Что примечательно, ученым страны восходящего солнца удалось создать экземпляры тканей не только из эмбриональных стволовых клеток (как это обычно бывает), но и из «взрослых» клеток, присутствующих в кожном покрове и волосах.
У пересадки клонированных тканей самые радужные перспективы, т.к. в регенеративной терапии лишь несколько заболеваний можно вылечить пересадкой клеток, и куда больше - пересадкой функционирующих, «живых», тканей: начиная от наращивания потерянных конечностей и заканчивая раком.
Выращенные ткани, на данный момент, еще слишком малы для их практического применения, но, как заявлено в пресс-релизе исследовательского института, исследования направленные на создание тканей взрослого человека будут продолжаться. Кроме экспериментов с человеческими стволовыми клетками, японцы успешно проделали то же самое с клетками лабораторных мышей, даже создав на основе их тканей сеть нейронов, отвечающую на стимулирование.
Не заканчивая лабораторными крысами, продолжаем дальше: на основе мертвой клетки, 16 лет пролежавшей в замороженном состоянии (-20 по Цельсию, температура схожая с мерзлой почвой, в которой был найден известный мамонтенок Дима), была успешно клонирована мышь.
Исследователи института Riken выделили клеточное ядро из органа мертвой мыши и привили его к яйцеклетке живой мыши, результатом чего стало появление на свет клона, способного к репродукции. Это не просто новость, а Новость с большой буквы, ведь подобные опыты открывают дорогу к восстановлению вымерших видов животных на планете, таких как мамонты, саблезубые тигры и… отправляйтесь пересматривать Парк Юрского Периода.
И если еще до недавнего времени подобные опыты не заканчивались успехом и казались скорее фантастикой, нежели реальностью, у ученых впереди решение еще одного сложнейшего вопроса: скрещивание с ныне существующими видами. Тысячи лет назад не существовало как минимум половины распространенных ныне заболеваний, инфекций, вирусов и всего прочего, что способно убить «новое-старое» существо еще до рождения.
Для клонирования мамонта (который пока представляется наиболее безопасным, вероятным и реализуемым существом) исследователям нужно найти способ привить ядро клетки мамонта яйцеклетке слонихи, после чего имплантировать ее. Тем не менее, даже если «родить» живое существо не удастся - в процессе могут получиться клонированые эмбриональные стволовые клетки, что даст еще один толчок к работам в этой области.
