В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.
Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом . От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.
Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:
1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100 000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 -1:10.
2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).
3. Изотонический раствор.
Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).
Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.
Реакция кольцепреципитации. В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2 - 0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное «кольцо» - преципитат.
Реакция преципитации в агаре (геле). Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.
Реакция лизиса (иммунный цитолиз)
Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:
1. Антиген -микробы, эритроциты или другие клетки.
2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвуюищие в лизисе бактерий; гемолитическая- гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток- итолизины и т. д.
3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента.
4. Изотонический раствор .
Реакция преципитации (РП) - это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты, различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела, участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся мелкодисперсный комплекс антиген - антитело выявляется при определенных методах постановки реакции преципитации.
Реакция
кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при диагностике
сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную
преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В
качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки
кожи, шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и
используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца -
преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.
Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген - антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной температуре.
Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку. Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген - антитело появляются линии преципитации.
Реакция преципитации является очень чувствительным методом и ее применяют при исследовании различных белковых и полисахаридных антигенов в судебно- медицинской практике для определения видовой принадлежности пятен крови, спермы, сыворотки, имеющихся на белье и различных предметах. Эту реакцию можно также использовать для выявления различных примесей к молоку, рыбным и мясным продуктам, определения природы белков, входящих в краски старинных мастеров живописи.
РП ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности РП в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.
Механизм
Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды или чистых культур бактерий. В реакции используют прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата - помутнение.
Реакция кольцепреципитации ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно наслаивают 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Учет реакции производят через 1-2 мин. В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В контрольных пробирках преципитат не образуется.
В виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.
Реакция кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген . При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата (рис. 7.50). Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).
Рис. 7.50.
Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.
Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы (рис. 7.51). У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются, у неидентичных - пересекаются.
Рис. 7.51
Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген (Аг) в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена (рис. 7.52). Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Рис. 7.52.
Сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку геля параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку. Антитела иммунной сыворотки диффундируют в гель и образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации (рис. 7.53).
Рис. 7.53.
Реакция флоккуляции (по Рамону) {от лат. floccus - хлопья шерсти} - появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин-антитоксин или анатоксин-антитоксин (рис. 7.54). Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.
Рис. 7.54.
Штаммы возбудителя дифтерии - С. diphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре (рис. 7.55).
Рис. 7.55
Реакции преципитации (от лат. precipitation - стремительное падение вниз) основаны на формировании и осаждении (выпадении в осадок) комплекса растворимый молекулярный антиген - антитело в присутствии электролита.
Максимум преципитации достигается при смешивании растворимых антигена и антитела в эквивалетных или близких к эквивалентым количествах. Для получения реакции преципитации антиген в возрастающих концентрациях добавляют к раствору антитела. Количество осаждающихся иммунных комплексов вначале возрастает, а затем падает. В кривой преципитации можно выделит три зоны:
- избытка Ат (количество добавляемого антигена недостаточно для того, чтобы связать все антитела);
- эквивалентности (когда все Ат и Аг связаны в комплексы);
- избытка антигена (количество антигена превышает необходимое для связывания всех антител).
Рис. 18. Кривая преципитации
Различают несколько разновидностей реакций преципитации.
Реакции кольцепреципитации . В узкую пробирку наливают иммунную сыворотку, содержащую антитела, затем сверху осторожно наслаивают раствор, содержащий растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.
Рис. 19. Реакция кольцепреципитации
Радиальная иммунодиффузия по Манчини - метод, позволяющий количественно определять антигены и антитела.
Антитела смешивают с агаровым гелем, затем полученную смесь наносят на предметные стекла и оставляют для застывания. В застывшем геле вырезают лунки, вносят в них раствор антигена в различных концентрациях и оставляют не менее чем на 24 ч. Антиген диффундирует в гель, связывается с антителами, и при достижении точки эквивалентности происходит осаждение комплексов антиген - антитело в виде кольца, диаметр которого прямо пропорционален концентрации антигена. Таким способом получают калибровочную кривую, с помощью которой можно количественно определить исследуемый антиген.
Кольцо преципитации
Рис. 20. Калибровочная кривая
Для количественного определения антител применяют этот же метод в обратной последовательности: в гель добавляют антиген, а в лунки - антитела.
Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации. Смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью элекрофореза, затем в канавку параллельно зонам элекрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии преципитации.
Реакция преципитации
- РП (от
лат. praeci- pito
- осаждать,) - это формирование и осаж-дение комплекса растворимого молекулярно-го антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Он образуется при смешивании антигенов и антител в эк-вивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул. Это могут быть белки, комплексы белков с углеводами и липидами, бактериальные экстракты, различные дизаты или фильтраты бульонных культур микробов. Антитела, участвующие в реакции преципитации, называют преципитинами. Образующийся мелкодисперсный комплекс антиген - антитело выявляется при определенных методах постановки реакции преципитации.
Реакция кольцепреципитации предложена впервые Асколи. Ее используют при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии, менингита. Метод прост и доступен.
В узкие преципитационные пробирки разливают специфическую иммунную преципитирующую сыворотку и на нее очень осторожно наслаивают антиген. В качестве антигена берут, например, при диагностике сибирской язвы кусочки кожи, шерсти, шкуры павшего животного и др. Их кипятят, жидкость фильтруют и используют как антиген. Появление на границе двух жидкостей кольца - преципитата свидетельствует о наличии соответствующего антигена.
Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузионной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водорастворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более густой агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в разных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген - антитело. Реакцию преципитации ставят обычно при комнатной температуре.
Метод иммуноэлектрофореза получил широкое распространение в последние годы при исследовании антигенной структуры микробов. Комплекс антигенов помещают в луночку, которая находится в центре агарового геля, залитого на пластинку. Затем через агаровый гель пропускают электрический ток, в результате чего различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в поле электрического тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген - антитело появляются линии преципитации.
Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, пита-тельных средах и др. Широкое распростране-ние получили разновидности реакции преци-питации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони. радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др
Реакция радиальной иммунодиффузии . Иммун-ную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застыва-ния в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диф-фундируя в гель, образует с антителами кольце- зые зоны преципитации вокруг лунок (рис. 13.7). Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют лля определения содержания в крови иммуног-лобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяет-ся в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза зносят иммунную сыворотку, антитела кото-рой, диффундируя в гель, образуют в месте — встречи» с антигеном линии преципитации.
Иммунная электронная микроскопия - элек-тронная микроскопия микробов, чаще ви-русов, обработанных соответствующими ан-тителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов обра-зуется «венчик» из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами.
123. Реакция преципитации в геле для определения токсигенности микроорганизмов, механизм, методы постановки.
Реакция преципитации (РП) — это формирова-ние и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количес-твах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в геле, а другой - антиген - наслаивается на первый в виде раствора.
Антиген, диффундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хорошо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще более простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследовании перекрестных реакций.
Для постановки реакции по Оухтерлоню используют 1%-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5-6 мм - одна в центре чашки, 4-5 - по окружности на расстоянии 1-2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагностическую преципитирующую сыворотку, а в периферические - раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной температуре.
Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где со-здаются их эквивалентные концентрации, образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных.
Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектрофорез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения.
Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагностическим методом.
Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора Аг (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита.
Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых коли-чествах, которые не обнаруживаются химическим путем.
Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические час-тицы белково–ПС прир: экстракты из мкÒ, органов и тк, пат материала; продукты распада бакте-риальной клетки, их лизаты, фильтраты. Преципитиногены обладают термоустойчивостью, поэтому для их получения материал подвергается кипячению.
В РП используются жидкие прозрачные Аг.
Преципитирующие сыворотки обычно получают гипериммунизацией кроликов циклами в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.
Постановка РП Асколи. В узкую пробирку с небольшим кол-вом неразведенной преципитирующей сыворотки, держа ее в наклонном положении, пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем Аг.
Чтобы не смешать две жидкости, пробирку осторожно ставят вертикаль-но. При положительной реакции в пробирке на границе между сыворот-кой и исследуемым экстрактом через 5–10 мин появля-ется серовато–белое кольцо. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Реакция Асколи применяется для идентификации сибиреязвенного, туляремийного, чумного Аг.
Она нашла также применение в су-дебной медицине для опред-я видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен, в санитарной практике при выявлении фаль-сификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. Не-достатком этой РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав Аг, участвующих в формиро-вании преципитата.
Реакция преципитации Оухтерлони. Реакцию ставят на чашках Петри в лунках агарового геля.
В качестве геля используют хорошо отмытый прозрачный агар. Аг и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном рассто-янии. Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют через 24–48 ч иммунный комплекс в виде белой полосы.
При наличии сложного по составу преципитиногена возникает несколько полос. При этом полосы серологически родственных антигенов сливаются воедино, а полосы разнородных пере-крещиваются, что позволяет определить детали антигенной структуры исследуемых веществ.
Широко используется для диагностики заболева-ний, вызываемых вирусами и бактериями, продуцирующими экзотоксины.
3.Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнару-жения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обыч-ных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчай-шим микроорганизмам.
РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ.
Реакция преципитации.
Для этого эритроциты обрабаты-вают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей.
Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритро-цитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.
Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пу-говицы»
Похожая информация:
Поиск на сайте:
Реакция кольцепреципитации
Реакция кольцеприцепитации – одна из наиболее простых серологических методов. Она выполняется в узких преципитационных пробирках. Сначала во все пробирки поровну разливают прозрачный раствор антигена, взятого в нескольких разведениях (1:2; 1:4; 1:8; 1:16).
Соединение антигенов и антител происходит на границе соприкосновения реагентов. В результате этого взаимодействия в положительных случаях (когда антиген соответствует антителу) через некоторое время происходит образование преципитата в виде опалесцирующего кольца.
Реакция нашла широкое применение в медицинской практике для выявления в шерсти, шкурах, мясе животных сибиреязвенного антигена (реакция Асколи); для обнаружения других возбудителей инфекционных болезней в патологическом материале, полученном от больных, или в объектах внешней среды, а также в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белка в частности, белка крови или других биологических жидкостей.
Иммунодиффузия по Оухтерлони
Реакция преципитации может быть поставлена в агаровом геле.
Метод основан на том, что частицы антигенов и антител из-за различных размеров диффундируют в геле с неодинаковой скоростью и вследствие этого продвигаются на разные расстояния. Это позволяет разделить отдельные системы антигенов в тех случаях, когда они находятся в смеси, и, следовательно, дает возможность изучить антигенную структуру бактерий и сложных белковых веществ, сывороток и тканей животных.
Наглядный и эффективный метод преципитации в геле предложил Оухтерлони.
На чашках Петри с агаром делают небольшие лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. В один из них наливают антиген, в другие — сыворотки. Компоненты реакции диффундируют в геле по направлению друг к другу и образуют видимую линию преципитации там, где антигены встречаются с оптимальными концентрациями специфических для него антител. Поскольку реагенты диффундируют из лунок концентрически, можно провести сразу несколько исследований, если разместить вокруг лунки с антителами несколько лунок с разными антигенами (или с разными разведениями одного и того же антигена).
Реакция Оухтерлони дает возможность делать заключение о природе антигена по известной сыворотке и, наоборот, по известному антигену определяется природа антител.
Преимущество метода – в том, что он позволяет сравнить антигенные компоненты сложных смесей и судить об их общности или различиях. Для сравнения общности антигенов готовят агар с лунками: в одну наливают антисыворотку, в другие – сравниваемые антигены. Если антигены различны, то полосы преципитации располагаются неодинаково.
Иммуноэлектрофорез
В последние годы для тонких иммунологических исследований применяется метод иммуноэлектрофореза. Метод впервые описали П.
Грабар и К. А. Уильямс в 1953 г. Он представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле на стеклянных пластинках с иммунодиффузией. В начале проводится электрофоретическое разделение антигена, зачастую представляющего собой смесь белковых или других молекул. Для этого антиген вносят в заранее вырезанную в агаре лунку, и пластинку с агаром на некоторое время помещают в зону постоянного электрического тока.
Из-за разной скорости движения молекул происходит разделение антигена на составляющие части. После этого в канавку, вырезанную в направлении, параллельном движению тока, вносят преципитирующую иммунную сыворотку.
Антиген и антисыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу.
Преципитация
Каждый антиген дает зону преципитации в виде дуги с соответствующими для него антителами. Число, положение и форма этих линий дают представление о составе исходной смеси антигена.
Реакция флоккуляции
Метод предложен Рамоном в 1924 году.
Он основан на том, что смесь токсина с антитоксической сывороткой в определенных условиях дает помутнение и выпадение осадка. При этом реакция наступает раньше в тех пробирках, где количество антитоксина соответствует дозе, полностью нейтрализующей данное количество токсина.
Следовательно, если известна сила токсина, то можно установить количество антитоксина в неизвестной испытуемой сыворотке. Для этого готовят несколько разведений исследуемой сыворотки, добавляют к каждому разведению одинаковые количества известного токсина, после чего наблюдают, в какой из пробирок раньше всего наступит флоккуляция (помутнение раствора). Определяют инициальную флоккуляцию. Затем производиться расчет.
Например, требуется определить концентрацию противодифтерийных антител в исследуемой сыворотке. В реакции применяется дифтерийный токсин, содержащий 50 Lf в 1 мл (Lf – это минимальное количество токсина, которое нейтрализуется 1 антитоксической единицей (АЕ) антисыворотки.
Допустим, что инициальная флоккуляция отмечена в пробирке, где находилось 0,2 мл этой сыворотки и 2 мл известного токсина активностью 100 Lf (50 Lf х 2).
Значит, 0,2 мл сыворотки нейтрализовали этот токсин. Следовательно, 0,2 мл сыворотки содержат 100АЕ, а в 1 мл этой сыворотки концентрация антител соответствует 500 АЕ (100 АЕ х 5).
Аналогичным методом реакцию флоккуляции можно применять и с противоположной целью – для определения иммунизирующих свойств анатоксинов.
Для этого необходима стандартная антитоксическая сыворотка.
Реакция нейтрализации
Реакция применяется при диагностике пищевых бактериальных отравлениях для определения в исследуемом материале бактериальных токсинов. Кроме того, ее можно ставить при исследовании некоторых объектов внешней среды на содержание патогенных бактерий, продуцирующих токсины, например, при исследовании почвы на наличие возбудителей столбняка или газовой гангрены.
Известно, что токсин в смеси с гомологической антитоксической сывороткой не проявляет своего токсического действия, так как токсин нейтрализуется. Реакция взаимодействия токсина с антитоксином, как правило, строго специфична, поэтому для постановки реакции нейтрализации с целью определения типа токсина необходимо иметь диагностические сыворотки, специфические к каждому виду и типу токсина. Можно применять одновременно применять смесь 2-3 антитоксических сывороток и более, если предполагается наличие в исследуемом материале несколько токсинов.
Реакция нейтрализации позволяет определить вид и тип токсина возбудителя.
Исследуемым материалом может быть фильтрат пищевых продуктов, предположительно вызвавших отравление, смывы с посуды, где находились эти продукты и др.
Предварительно проводится нейтрализация предполагаемого токсина. Для этого в пробирку с исследуемым материалом (опытная пробирка) добавляется антитоксическая диагностическая сыворотка (она содержит антитела к искомому токсину); в другую пробирку (контрольную) доливается равный объем физиологического раствора.
После кратковременной инкубации содержимое пробирок вводится двум группам белых мышей (опытной и контрольной).
Результаты реакции нейтрализации учитывают сразу же после гибели контрольных животных. В таком случае факт выживания животных, получивших антитоксическую сыворотку вместе с исследуемым материалом, указывает на наличие в нем токсина, соответствующего вводимой сыворотке.
Достоинством реакции нейтрализации является высокая достоверность получаемых результатов.
Однако по своей чувствительности и быстроте получения ответа она уступает некоторым другим методам исследования.
Реакции лизиса
Реакциями лизиса принято называть растворение корпускулярных антигенов под действием антител, специфичных в отношении данного антигена, в присутствии комплемента.
Из иммунных реакций, основанных на феномене лизиса бактерий и других корпускулярных антигенов, применяются, главным образом, реакции бактериолиза и гемолиза.
Реакция бактериолиза
Реакция происходит как in vitro, так и in vivo. Последняя известна под названием реакции В.И. Исаева – Пфейффера.
Этими учеными показано, что если морских свинок предварительно проиммунизировать холерными антигенами, то последующее введение им в брюшную полость высоковирулентной культуры холерного вибриона не вызывает заражения животных, так как в брюшной полости происходит растворение возбудителя под воздействием специфических антител.
В дальнейшем И.
И. Мечников доказал, что аналогичное растворение холерного вибриона под воздействием иммунной сыворотки происходит и в пробирке, если к основным компонентам добавить свежую сыворотку — источник компле-мента. Растворение бактерий под действием специфических антител в присутствии комплемента получило название реакции бактериолиза.
При постановке реакции бактериолиза сначала готовят ряд 10-кратных разведений исследуемой сыворотки. Затем в каждуюпробирку добавляют одинаковое количество (по 1-2 капли)микробной взвеси. К смеси добавляют комплемент. После инкубирования при 37 °С из каждой пробирки делается высев смеси на питательную среду для установления наличия или отсутствия жизнеспособных бактерий.
Реакцию можно применять для определения антител с помощью известного микроорганизма или для определения вида микробов с помощью диагностической иммунной сыворотки.
В практической работе бак-териологов эта реакция применяется редко, главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов.
Реакция гемолиза
Механизм гемолиза аналогичен механизму бактериолиза.
Испо-льзуемые в реакции эритроциты являются антигеном. Источником ан-тител является антиэритроцитарная сыворотка (например, если в реакции применяются бараньи эритроциты, то необходимую сыворотку со специфическими антиэритроцитарными антителами получают от кро-ликов, иммунизированных бараньими эритроцитами).
В качестве комплемента в реакциях лизиса чаще всего используется сыворотка крови морской свинки, так как в ней содержится значительно больше комплемента, чем в сыворотках других животных.
В тех случаях, когда антитела в присутствии комплемента разрушают эритроциты, из них выходит гемоглобин, и реагирующая смесь из мутной взвеси эритроцитов превращается в прозрачную красную жидкость (лаковая кровь).
Такую реакцию называют гемолизом. В лабораторной практике она применяется в качестве пока-зателя адсорбции комплемента в реакции связывания комплемента.
Похожая информация:
Поиск на сайте:
План лекции: Предмет и краткая история развития микробиологии. Общие свойства микроорганизмов и их положение в природе.
преципитации реакция
Ветеринарная микробиология и ее задачи
mir.zavantag.com > Биология > Лекция
1 … 7 8 9 10 11 12 13 14 15
| ^
РА впервые разработана М.Грубером в 1896 г. Сущность реакции заключается во взаимодействии антитела с антигеном, в результате чего происходит склеивание (агглютинация) микробов с образованием хлопьев, комочков, видимых невооруженным глазом. РА широко применяется для серологической диагностики многих бактериальных инфекций (бруцеллеза, сапа, сальмонеллезов, колибактериоза и др.) и для серологической идентификации видов и типов выделенных микроорганизмов. Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровекапельный, кольцевая реакция с молоком, реакция гемагглютинации и ее варианты (РЗГА, РНГА), антиглобулиновый тест Кумбса и др. ^ – вместо сыворотки берется кровь. Ставят пластинчатую реакцию. Диагностируют пуллороз кур и индеек, микоплазмоз кур. Реакция Кумбс�� позволяет выявить неполные антитела. Последние одновалентны, в связи с чем они тормозят образование агглютината. Метод основан на применении антиглобулиновой сыворотки, служащей посредником для соединения неполных антител, фиксированных на корпускулярных антигенах (эритроциты, бактерии). ^ – она не относится к серологическим и диагностически точным реакциям, однако позволяет обнаружить антиген – гемагглютинин и установить гемагглютинирующие свойства (способность агглютинировать эритроциты) у некоторых бактерий и микоплазм. РНГА – в последние годы заняла одно из ведущих мест в серодинамике. Сущность ее заключается в том, что белковые молекулы антигена соответствующего возбудителя или антитела предварительно адсорбируют на обработанных танином эритроцитов барана или др. животного. Затем ставят реакцию путем смешивания сенсибилизированных эритроцитов с сыворотками крови больных животных или во втором случае с исследуемым антигеном. При наличии в сыворотке спец. Антител на данный антиген (или наоборот) происходит агглютинация эритроцитов – реакция положительная. Предложена Р.Краусом в 1897 году. Преципитация – явление, наблюдающееся при взаимодействии антител-преципитинов и антигена-преципитиногена. Сущность реакции заключается в изменении дисперсности коллоидов антигена и их осаждением под влиянием специфических антител, находящихся в иммунной сыворотке. РП может быть поставлена в пробирках в жидкой среде (реакция кольцеприципитации) или в агаровом геле (пластинчатая РДП). Реакция кольцеприципитации впервые предложена Асколи (1910), наиболее широко ее применяют в целях диагностики сибирской язвы. При проведении ветеринарной экспертизы РП является методом определения фальсификации мясных, мучных и др. продуктов. Особое значение эта реакция имеет в судебно-медицинской экспертизе при определении видовой принадлежности крови. Применение реакции преципитации в жидкой среде не позволяет, однако, охарактеризовать гетерогенность антигенов, т.е. количество и концентрацию антигенов в препарате. Данные сведения можно получить, если поставить РП в геле (чаще агаровом). Обладая скоростью передвижения, различные антигены препарата неодинаково диффундируют, образуя в толще прозрачного геля не месте встречи с гомологичным антителом преципитаты. Локализация и концентрация линий преципитинов будут характерны для каждого компонента антигенного препарата, что служит критерием его качества. Путем разведения препарата можно характеризовать относительное содержание в нем антигенов. Разработано несколько методов постановки РДП: метод прямой одномерной диффузии по Удену (1946), метод простой радиальной иммунодиффузии по Манчини (1963), метод двойной диффузии в агаровый гель по Оухтерлони (1948) и др. ^
(РН) на модели столбнячных токсинов и антитоксинов. Сущность РН заключается в способности гомологичных антител иммунной сыворотки подавлять (нейтрализовать) инфекционные свойства возбудителя болезни или продуктов его жизнедеятельности. Для установления результата реакции смесью антиген-антитело заражают лабораторных животных, КК, КЭ. Показатель положительно РН – отсутствие гибели биологических тест-систем. В бактериальной практике РН применяют при диагностике анаэробной энтеротоксемии, ботулизма и др. РН проводят с целью обнаружения и титрования токсинов, анатоксинов или антитоксинов. Используют для выявления антител в сыворотке крови и для обнаружения в исследуемом материале антигена (при бруцеллезе, сапе, риккетсиозах, туберкулезе и др.). Данная реакция относится к непрямой двухсистемной. В ней участвуют 5 компонентов:
Компоненты 3,4,5 составляют индикаторную систему. Если антиген и антитело испытуемой сыворотки соответствуют друг другу, возникает иммунный комплекс антиген-антитело, который связывает и извлекает из среды, где протекает реакция, комплемент. При отсутствии в испытуемой сыворотке антител, соответственных антигену, указанный комплекс не образуется – комплемент остается свободным. Поскольку это невидимые процессы, то для решения вопроса, что же произошло с комплементом, в пробирку в качестве индикатора вводят компоненты гемолитической системы – гемолитическую сыворотку + эритроциты. Если в бактериологической системе комплемент связался – гемолиз эритроцитов не произойдет, результат положительный – в сыворотке содержатся антитела. Наличие гемолиза служит показателем наличия свободного комплемента в бактериологической системе, что возможно только при отсутствии в испытуемой сыворотке антител – результат отрицательный. РСК протекает при строгих количественных соотношениях компонентов. Это достигается их предварительным титрованием (комплемент и гемолитическую сыворотку титруют в день постановки реакции; микробный антиген – один раз в течение 2-3 месяцев). Титрование – определение наименьшего количества того или иного компонента в реакции для проведения реакции, лишнее или недостаток – искажение результатов. РДСК – это вариант РСК, но отличающийся тем, что первая фаза реакции протекает в течение 16-18 часов на холоде (40С), что повышает чувствительность из-за более длительной адсорбции комплемента комплексом антиген-антитело. |
7 8 9 10 11 12 13 14 15
Схожі:
| Определение понятия «экологическая микробиология» Общей микробиологии, изучающий взаимоотношения микроорганизмов между собой, с объектами внешней среды и макроорганизмом |
Наиболее общие и фундаментальные понятия, отражающие существенные,… Философия -наука, к-рая изучает самые общие положения о человеке, природе и о познании |
||
| План Предмет и метод дисциплины «Международные экономические отношения»… Предмет и метод дисциплины «Международные экономические отношения» и история развития мэо |
Вопросы к экзамену по курсу «юридическая психология» Для студентов… Понятие о юридической психологии. Предмет, задачи и история развития юридической психологии |
||
| 1. Предмет и метод истории политических и правовых учений > Предмет… Это обусловлено тем, что в рамках данной юридической дисциплины исследуется и освещается специфический предмет – история возникновения… |
1.
История философии как наука. Её предмет и метод |
||
| Министерство образования и науки республики казахстан альянс студентов… Настоящее положение о республиканском конкурсе «Студент Года- 2011» (далее по контексту конкурс) определяет его цели и задачи, участников… |
Определение терминов «микробиология» и«микроорганизм» … |
||
| Вопросы для подготовки к зачету по дисциплине «конфликтология» Конфликтология как наука: предмет, цели, задачи, актуальные проблемы, значение на современном этапе развития общества |
О краевом конкурсе видео-роликов «к-роли-к!» Общие положения Настоящее Положение определяет цели, задачи, принципы Конкурса, порядок его организации и проведения, порядок участия и определения… |
Додайте кнопку на своєму сайті:
Школьные материалы
mir.zavantag.com
Реакция преципитации
Преципитация и агглютинация - это довольно сходные реакции, которые различаются главным образом на основании физических свойств АГ.
В первом случае он представлен в растворимой, во втором - в корпускулярной формах. В основе РП лежит образование преципитата в процессе реакции АГ-АТ. РП высоко специфична и чувствительна.
Ингредиенты реакции:
1. растворимый АГ или гаптен (преципититоген);
2. АТ - преципитины {иммунная преципитирующая сыворотка; получают иммунизацией кроликов соответствующими растворами АГ-ми);
Реакция преципитации
изотонический раствор хлорида натрия или агаровый гель.
Методы постановки РП:
1) РП в растворах - р.
кольцепреципитации;
2) РП в геле.
Реакцию кольцепреципитации ставят в узких преципитационных пробирках, в которые разливают преципитирующие сыворотки.
Затем наливают раствор преципитиногена. При положительной реакции на границе соприкосновения ингредиентов появляется мутное кольцо преципитации.Примером такого способа постановки РП является реакция термопреципитации по Асколи, применяемая для обнаружения термостабильного гаптена возбудителя сибирской язвы, извлекаемый из органов животных, кожи, шерсти экстракцией при кипячении.Одна из разновидностей РП в геле (реакция Оухтерлони) позволяет определять токсигенность дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки.
В чашку Петри с питательной средой помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой и засевают исследуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги. Инкубируют при 37 ПС в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации.Реакция преципитации в геле носит название иммунодиф-фузии.
Часто форезом в геле - иммуноэлектрофорез. Принцип метода: исследуемый антиген фракционируют электрофорети-чески. полученные фракции анализируют методом двойной диффузии при помощи антисыворотки.
Реакция Асколи ставится для диагностики сибирской язвы с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь: преципитиноген - гаптен B.
Antrachis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая сибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.
Приготовление термопреципитиногена.
1. 8 колбочку, содержащую 1 г измельчённой кожи или 1 мл культуры В. ап1Ьгас!3, налить 10 мл физиологического раствора.
2. Колбу поместить в кипящую баню на 30-45 минут.
3. Просрильтровать через асбестную эату. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен. Для реакции преципитации фильтрат разводится в 100 раз и более.
Постановка реакции кольцепреципитации.
1) В преципитэционную пробирку наливается 0,3 мл пре-ципитирующей сыворотки цельной или в разведении 1:5, 1:10.
2) По стенке пробирки осторожно наслаивается преципи-тиноген- Реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо выпадающего белка не позднее 5-15 минут.
При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:
а) антиген и физиологический раствор;
б) специфическая сыворотка и физ.
в) антиген и неспецифическая сыворотка.
Во всех контрольных пробирках помутнения не должно быть Для реакции преципитации пользуются специальными преципитационными пробирками высотой 40-60 мм и диаметром 4-5 мм, преципитация в узких пробирках наступает значительно скорее и проявляется более чётко, чем в обычных пробирках, их тщательно моют и высушивают, чтобы стекло их было совершенно прозрачным и сухим.
